Slug和E－cadherin在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

錢 江 陳旺盛 文坤明 傅仲學 王素梅 (重慶醫科大學附屬第一醫院普通外科，重慶 40006)

Slug作為Snail鋅指轉錄因子家族成員之一，有高度保守的C2H2型鋅指結構域，通過連接到E－box以抑制靶基因的轉錄。上皮細胞鈣黏蛋白(E－cadherin)是上皮組織中類依賴Ca2+的細胞間粘連跨膜糖蛋白分子，可以在胞漿內形成E－鈣黏蛋白－β－連環蛋白－α－連環蛋白復合體，此復合體再直接連接到肌動蛋白細胞骨架上，用以維持細胞間黏附的穩定性和細胞的極性。Slug是E－cadherin啟動子的抑制子，參與控制細胞分化和凋亡的不同進程。本研究探討Slug和E－cadherin的表達與結直腸癌的發生、發展作用以及Slug和E－cadherin之間有無相關性，為診斷、治療、預防結直腸癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2003年1月至2004年3月重慶醫科大學附屬第一醫院住院接受手術治療的結、直腸癌患者65(男37，女28)例，年齡24～83(中位62)歲，全部病例均經病理證實。其中結腸癌39例，直腸癌26例;高中分化腺癌36例，低分化腺癌29例;有淋巴結轉移者30例，無淋巴結轉移者35例。Dukes分期:A+B期31例，C+D期34例。另取癌旁組織(距癌組織5 cm以上)25例作為對照組。所有病例術前均未行放化療及免疫治療。所有標本均經過甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規HE染色。65例患者無住院期間死亡，隨訪日期從患者術后第1日開始計算，隨訪至2010年1月，隨訪時間6～60個月、失訪3例。試劑:鼠抗人Slug單克隆抗體(SC－166476)購自美國 Santa Cruz公司，鼠抗人 E－cadherin單克隆抗體(SC－7963)購自美國Santa Cruz公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 石蠟切片脫蠟至水;滴加一抗的組織切片用EDTA緩沖液高壓熱修復10 min，修復后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液;用50～100 ml正常山羊血清封閉，滴加一抗，工作濃度為1∶100，4℃冰箱孵育過夜;滴加生物素標記的第二抗體，滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液;DAB顯色;以PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 結果判定 根據染色程度和染色細胞百分比進行評分，染色陽性信號以細胞核和細胞質著色為準，呈棕黃色顆粒，細胞染色強度明顯高于背景呈棕黃色者為陽性細胞。按切片中陽性細胞比例分別記0～4分:在5個高倍視野下，切片中陽性細胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51%～75%記3分，＞75%為4分;按染色深淺分別為0～3分，染色深度以多數細胞為準，無陽性細胞為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;免疫反應的得分為陽性細胞的百分率得分與免疫染色的強度得分的乘積，再按這兩項指標的總積分將結果分成4級:0分為(－)，1～2分為(+)，3～4分為()，5～12 分為()。其中(－)和(+)為低表達，()和()為高表達。

1.3 統計學處理 以SPSS 13.0統計軟件包進行χ2檢驗，Kaplan－Meier法計算生存率，Log－rank檢驗，單因素Cox回歸分析，Cox比例風險模型多因素分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Slug和E－cadherin蛋白在不同組織中的表達 Slug位于結直腸癌組織的細胞質中，陽性率為47.1%，在正常大腸黏膜組織中幾乎無表達，正常大腸黏膜E－cadherin定位于上皮細胞膜，大腸癌組織中 E－cadherin胞膜表達不同程度缺失，為55.4%。見圖1。

圖1 Slug和E-cadherin在結腸的表達(DAB，×200)

2.2 Slug和E－cadherin蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 Slug蛋白異常表達與腫瘤部位、腫瘤大小相關性不顯著，而與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、Dukes分期相關性均有統計學意義(P＜0.05)。E－cadherin蛋白陽性表達與腫瘤部位、腫瘤大小相關性不顯著，而與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、Dukes分期相關性均有統計學意義(P＜0.05)，表1。

2.3 結直腸癌中Slug和E－cadherin蛋白表達相關性 經統計分析在結直腸癌中Slug陽性表達32例，其中E－cadherin表達缺失13例;Slug陰性表達33例，其中E－cadherin表達缺失23例，二者表達無相關性(P=0.644)。

2.4 生存分析 Slug陽性表達患者生存時間明顯短于Slug陰性表達患者(P＜0.05);E－cadherin膜表達缺陷患者生存時間明顯短于有E－cadherin表達缺陷患者(P＜0.05)，見圖2。

2.5 Cox比例風險模型多因素分析 先用單因素Cox模型對腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移、Dukes分期、浸潤深度、腫瘤大小進行初步篩選，然后用Cox多因素分析，統計分析表明 Slug、E－cadherin、淋巴結轉移、Dukes分期可成為影響結直腸癌預后的獨立因素(P＜0.05);其中Slug相對危險度為2.832(P=0.000)，E－cadherin相對危險度為2.741(P=0.007)，見表2。

圖2 Slug和E-cadherin表達患者生存曲線

表1 Slug和E-cadherin的表達與臨床病理因素的關系〔n(%)〕

表2 結直腸癌患者預后多因素分析

Slug高表達參與了結腸癌的發生、發展和轉移，與文獻報道基本一致〔1〕。但與Martin等〔2〕研究乳腺癌Slug表達與TNM分期無明顯相關不一致，可能所涉及信號通路不同有關。Slug高表達也預示著結直腸癌患者有較高的淋巴結轉移率，提示病人的預后不佳，其測定同樣有助于早期判斷預后。本研究提示Slug的高表達與腫瘤轉移密切相關，且是影響結直腸癌預后的獨立因素。

E－鈣黏蛋白(E－cadherin)是一種單跨膜糖蛋白，能在細胞與細胞黏附中以同種分子間，拉鏈式結合形式介導細胞黏附，研究證實在絕大多數惡性腫瘤中如乳腺癌、腸癌、結直腸癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮膚癌、腎癌和肺癌都存在有上皮－間葉變(EMT)造成E－cadherin表達下調，并導致介導的細胞－細胞間黏附功能削弱或喪失〔3〕，并致腫瘤細胞極易脫離原發灶且易于向周圍組織侵襲，為腫瘤的遠處轉移提供了必要的條件。本研究提示E－cadherin異常表達可能與結腸癌的發生有關。邱雪彬等〔4〕研究認為E－cadherin表達與某些腫瘤的分化程度有關，而本研究提示 E－cadherin可能參與調控結腸癌的分化。Nabeshima等〔5〕研究發現腫瘤細胞的侵襲能力與 E－cadherin表達有關，而在人體實體瘤的研究中也發現非小細胞肺癌〔4〕、舌癌〔6〕中E－cadherin異常表達與腫瘤轉移密切相關。本文顯示E－cadherin膜表達缺失與結腸癌浸潤、轉移密切相關，表明E－cadherin具有抑制腫瘤侵襲的功能，且是影響結直腸癌預后的獨立因素。這可能與結腸癌E－cadherin膜表達缺失病例較易發生浸潤、轉移而影響預后有關。本研究還表明，Ecadherin和Slug的表達均與病人腫瘤部位、腫瘤大小無關。本實驗Ecadherin和Slug蛋白表達相關性分析顯示，Ecadherin和Slug表達無相關性，這與Shioiri等〔7〕研究結果一致，這種相關性的缺乏可能是由于在結直腸癌中E－cadherin下調常常是通過啟動子的超甲基化的作用而不是通過基因結構的改變引起〔8〕。

1 Zhang KJ，Zhang BY，Zhang KP，et al.Clinicopathologic significance of slug expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma〔 J〕.World J Gastroenterol，2010;16(20):2554－7.

2 Martin TA，Goyal A，Watkins G，et al.Expression of the transcription factors snail，slug，and twist and their clinical significance in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2005;12(6):488－96.

3 黃 菊，程夏楷，楊 彬，等.E－鈣黏蛋白復合體及其對腫瘤細胞的作用〔J〕. 生命的化學，2005;25(3):247－50.

4 邱雪彬，楊 秀，李慶昌，等.上皮性鈣黏附蛋白和β－連環素的表達與非小細胞肺癌預后的關系〔J〕.中華病理學雜志，2002;31(4):318－21.

5 Nabeshima K，Inoue T，Shimao Y，et al.Cohort migration of carcinoma cell:differetiated colorectal carcinoma cells move as coherent cell clusters or sheets〔J〕.Histol Histopathol，1999;14(6):1183－97.

6 鄭天榮，李建成，劉秀英.E－鈣黏附素和CD44v6在舌癌中的表達及其意義〔J〕. 診斷病理學雜志，2002;9(2):98－9.

7 Shioiri M，Shida T，Koda K，et al.Slug expression is an independent prognostic parameter for poor survival in colorectal carcinoma patients〔J〕.Br J Cancer，2006;94:1816－22.

8 Garinis GA，Menounos PG，Spanakis NE，et al.Hypermethylation－associated transcriptional silencing of E－cadherin in primary sporadic colorectal carcinomas〔J〕.Pathol，2002;198:442－9.