金雀異黃酮預適應對大鼠小腦浦肯野細胞缺血再灌注損傷的保護作用

趙士弟 黃 麗 姜之全 姜麗娜 王小嬌 陳前芬 (蚌埠醫學院病理生理學教研室，安徽 蚌埠 233030)

藥物預處理是否具有腦保護作用，報道并不多見。金雀異黃酮(GEN)是大豆異黃酮的主要活性成分，為一種選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、抗氧化劑和酪氨酸蛋白激酶抑制劑。GEN對腫瘤、骨質疏松、心血管等疾病的防治作用已有報道〔1〕，且GEN可促進腦缺血組織的海馬神經的再生〔2〕。本實驗觀察GEN對腦缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用。本實驗選擇觀察小腦浦肯野神經元缺血再灌注損傷的存活率是因其對缺血敏感，缺血性損傷和死亡在小腦腦片上容易識別。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與設備 SD大鼠(蚌埠醫學院實驗動物中心提供)，Genistein(Sigma公司)，CK(南京建成生物工程研究所)，Tris-GTP、EGTA、Mg2+-ATP、HEPES(Sigma 公司)、振蕩切片機(美國VIBRATOME公司)，721分光光度計(上海湖光科學儀器公司)。

1.2 溶液配制 人工腦脊液(ACSF)Ⅰ組成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，0.5 CaCl2和4 MgSO4，pH 7.35～7.45(1 mol/L NaOH 調節pH)。ACSFⅡ組成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，2.4 CaCl2和 1.3 MgSO4，pH7.35～7.45(1 mol/L NaOH調節pH)。

1.3 腦片的制備 取出生后17～21 d SD大鼠，放入4 L鐘形玻璃容器，容器內放入2 ml異氟烷，行異氟烷吸入麻醉。刀片斷頭，取出小腦，去除腦干及小腦半球，將小腦蚓部放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的冰水混合的ACSFⅠ中。將小腦蚓部切成400 μm腦片，放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的ACSFⅡ，在25℃條件下孵育1 h以恢復細胞功能。

1.4 體外缺血再灌注模型制備〔3〕將小腦腦片轉移至40 ml無氧(通95%N2和5%CO230 min)無糖的ACSF培養液中培養20 min模擬缺血，再轉移至充分氧合的ACSFⅡ培養液中培養4 h，用來模擬再灌注，使OGD造成的細胞損傷和死亡更加明顯。

1.5 實驗分組 ①正常對照組:以充分氧合的ACSFⅡ培養腦片6 h;②缺血再灌(I/R)組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養腦片100 min，再轉移至OGD液20 min，最后轉移至充分氧合的ACSFⅡ培養即再灌4 h;③GEN高、中、低劑量組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養腦片60 min，后分別轉至含GEN 200、100和50 mol/L的ACSFⅡ培養腦片20 min，再轉至無GEN的ACSFⅡ培養腦片20 min后轉移至OGD液20 min，最后再灌4 h;④尼莫地平組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養腦片100 min，再轉移至含尼莫地平10 mol/L OGD液20 min，最后轉移至充分氧合的ACSFⅡ培養即再灌4 h。

1.6 形態學實驗 再灌注后的腦片置于4%的甲醛溶液4℃保存24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，取腦片內部組織做病理切片(距邊緣約100 μm組織)以排除在腦片制備中直接受損的區域并進行HE染色，檢測未受損浦肯野細胞的百分比即存活率。有下列特征之一則視為受損:腫脹、空泡化或細胞固縮核深染。腦片的每個區域至少有50個浦肯野細胞被計數或3個區域計數的總數超過150個浦肯野細胞。

1.7 小腦組織CK活力測定 按照試劑盒說明書操作。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析。實驗結果以±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 糖氧剝奪和恢復糖氧灌流誘導浦肯野細胞損傷 見圖1。

圖1 GEN對浦肯野細胞I/R損傷病理學的影響(HE，×400)

2.2 GEN預適應20 min后糖氧剝奪和恢復糖氧灌流浦肯野細胞的存活率變化 與正常對照組相比，I/R組浦肯野細胞的存活率明顯降低(P＜0.0005)。與I/R組比較，GEN 200和100 mmol/L預適應組浦肯野細胞的存活率明顯增加(P＜0.005和P＜0.01)，GEN 50 mmol/L預適應組浦肯野細胞的存活率略有升高趨勢，但差異無顯著性。見表1。

表1 GEN對浦肯野細胞存活率BCK活性的影響(n=8，±s)

表1 GEN對浦肯野細胞存活率BCK活性的影響(n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.005，3)P＜0.001;與正常對照組比較:4)P＜0.0005

組別 劑量(mmol/L)存活率(%) CK(U/mg)正常對照組85±7 21.65±3.24 I/R組 0 31±74) 8.97±1.854)GEN組 50 35±9 10.03±2.39100 45±111) 12.47±2.681)200 59±92) 16.04±3.243)尼莫地平 10 46±101) 13.03±2.821)0

2.3 GEN預適應20 min后糖氧剝奪和恢復糖氧灌流小腦組織CK活性變化 與正常對照組相比，I/R組小腦組織CK活性明顯升高(P＜0.0005)。與 I/R組比較，GEN 200和100 mmol/L預適應組小腦組織CK活性明顯降低(P＜0.001或P＜0.01)，GEN 50 mmol/L預適應組小腦組織CK活性略有降低趨勢，但差異無顯著性。見表1。

3 討論

IPC是通過調動機體內源性物質如腺苷、緩激肽、降鈣素基因相關肽、PGI2、NO 等來提高缺血的耐受性〔4，5〕。目前，預適應的方法不再局限于腦缺血，而是涵蓋了許多“亞毒性”的侵害性物質或措施。藥理性預適應是根據IPC機制，通過藥物模擬或誘導機體內源性物質而起到預適應的作用〔6〕。

有關腦缺血再灌注損傷的模型較多，有在體的動物模型，也有離體的模型。OGD模型是一種較好的離體腦缺血模型，OGD模型是通過移除培養液中的葡萄糖和氧氣模擬缺血，再恢復到正常的培養條件模擬再灌注。該模型所得資料類似于采用其他在體或離體缺血模型的實驗資料，并且在實驗研究中的應用已得到認可。與在體的腦缺血再灌注損傷的模型相比，OGD模型便于控制和改變細胞外環境，可選擇特定類型的細胞，并能在體外研究單個細胞的胞內狀況，因此，這種模型在神經保護機制方面的研究是常用的。

細胞內鈣超載與自由基損害是腦缺血再灌注損傷的重要發病機制。腦缺血再灌注后，大量氧自由基產生，導致膜脂質過氧化，細胞膜的結構和完整性遭到破壞，最終使細胞膜的通透性增加，胞漿酶被釋放到細胞間隙，使腦組織中的酶活性降低。已知腦組織中廣泛存在CK，有實驗及臨床觀察證明腦缺血時腦組織CK釋放增加。因此，檢測腦組織中CK的含量變化可準確反映腦組織細胞受損的程度。本實驗結果提示GEN預適應可以減少腦缺血壞死的程度，對小腦浦肯野細胞缺血再灌注有保護作用。大量的研究表明，GEN類物質通過提高體內酶促抗氧化防御系統能力，清除氧自由基保護缺血再灌注的腦組織〔7〕。本實驗結果說明GEN也是通過提高體內酶促抗氧化防御系統能力，清除氧自由基來保護缺血再灌注的小腦浦肯野細胞。腦缺血后由于ATP生成減少，引發胞外大量的Ca2+內流，同時激活細胞內Ca2+庫的釋放，導致細胞內游離Ca2+超載，激活了各種降解酶如DNA酶、鈣調磷酸酶、蛋白酶和磷脂酶，同時過量Ca2+沉積于線粒體，使線粒體氧化磷酸化失耦聯進一步加重，膜電位喪失，呼吸鏈解體，導致細胞能量的嚴重丟失，同時致使O2經單電子還原生成超氧陰離子增多，產生的大量自由基，引起DNA、蛋白質和磷脂降解，細胞代謝、結構與功能多方面的異常改變，神經細胞逐步死亡〔8〕。本實驗表明GE N可能通過抑制細胞鈣通道，減輕細胞內鈣超載，進而減輕I/R損傷。近來研究也表明，大豆異黃酮可能通過抑制電壓依賴性鈣通道從而影響心肌細胞動作電位時程〔9〕。

1 龍 軍，張 良，袁冬平，等.大豆異黃酮對腦缺血再灌注大鼠海馬神經再生的影響〔J〕.南京中醫藥大學學報，2011;27(1):49-55.

2 Lim YJ，Zheng S，Zuo Z.Morphine preconditions purkinje cells against cell death under in vitro simulated ischemia-reperfusion conditions〔J〕.Anesthesiology，2004;100(3):562-8.

3 Zhao S，Chen N，Yang Z，et al.Ischemia deteriorates the spike encoding of rat cerebellar Purkinje cells by raising intracellular Ca2+〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;366(2):401-7.

4 Pasupathy S，Homer-Vanniasinkam S.Ischaemic preconditioning protects against ischaemia/reperfusion injury:emerging concepts〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg，2005;29(2):106-15.

5 Arrell DK，Elliott ST，Kane LA，et al.Proteomic analysis of pharmacological preconditioning:novel protein targets converge to mitochondrial metabolism pathways〔J〕.Circ Res，2006;99(7):706-14.6 熊利澤，路志紅.腦缺血預處理研究進展〔J〕.第四軍醫大學學報，2002;23(15):1347-8.

7 邢 巖，田慶偉，王永明，等.大豆異黃酮對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.營養學報，2006;28(1):85-6.

8 李智慧，田慶偉，邢 巖，等.大豆異黃酮對腦缺血再灌注模型小鼠抗氧化系統的影響〔J〕.天津醫科大學學報，2005;11(1):45-7.

9 馬麗娟，趙春燕，張文杰，等.大豆異黃酮對培養心肌細胞鈣電流和動作電位的影響〔J〕.中國老年學雜志，2006;26(2):206-8.