白藜蘆醇對老年大鼠心肌細胞線粒體細胞色素C氧化酶表達的影響

夏立志 胡秋玲 (哈爾濱市二四二醫院，黑龍江 哈爾濱 150066)

隨著人口老齡化，提高老年人的生活質量，延緩衰老一直是醫學界研究的熱點。線粒體在進行有氧呼吸時，伴有自由基的產生，將引起衰老。因此，清除自由基、保護線粒體的天然藥物對于抗衰老發揮重要作用〔1〕。白藜蘆醇對動脈粥樣硬化有保護作用，具有清除自由基、抗脂質過氧化等作用〔2〕，但白藜蘆醇對老年大鼠心肌線粒體能量代謝的影響未見報道。本實驗旨在為抗衰老藥物開發提供實驗依據，同時為老年心臟病患者的康復奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 純系雄性SD大鼠30只，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，3月齡大鼠10只作為青年組，體重(300±41.5)g;24月齡大鼠20只，體重(700±83.5)g，隨機分為老年組和用藥組，每組10只。室溫飼養，自由飲食。

1.2 藥物與處理 白藜蘆醇由本實驗室從虎杖中提取(99%，HPLC)，白藜蘆醇標準品由 sigma公司提供，實驗時用蒸餾水配成混懸液。用藥組每日予白藜蘆醇(70 mg/kg)連續灌胃4 w。每周稱重2次，根據體重調整劑量。青年組和老年組均灌胃等容量生理鹽水。

1.3 指標測定

1.3.1 心肌線粒體的提取 給藥4 w后斷髓處死。迅速取出心臟，一部分液氮凍存，用于提取組織 RNA。另外部分剪成小塊后立即用介質Ⅰ(0.25 mol/L蔗糖溶液，3.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)去除血污，用濾紙吸去表面的液體，稱重，勻漿，600 r/min離心5 min，取上清液于10000 r/min離心10 min。沉淀用介質Ⅱ(0.25 mol/L蔗糖溶液，2.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)懸浮，10000 r/min 離心10 min，沉淀懸浮在0.5 ml介質 Ⅱ 中，制備成線粒體懸液備用〔3〕。另一部分線粒體懸液經超聲波粉碎機粉碎，400 A，5 s/次，間隙 10 s，反復 4次使線粒體微粒破碎，4℃ 離心(2000 r/min，10 min)，取上清液供酶活力測定。以上操作皆在4℃ 以下進行。另一部分線粒體懸液直接供丙二醛(MDA)與蛋白質的測定。

1.3.2 測定方法 心肌線粒體蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G250法;超氧化物歧化酶(Mn－SOD)活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法;心肌線粒體MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法;線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅳ(CoⅣ)活力測定采用王學美等〔4〕的方法。CoⅣ mRNA表達采用 RT－PCR方法，CoⅣ和甘油醛－3－磷酸脫氨酸(GAPDH)引物序列用Prime軟件進行設計，并由上海生工合成，CoⅣ引物序列:上游:5′ACTACCCCTTGCCTGATGTG3′，下 游:5′ACTCATTGGTGCCCTTGTTC3′，擴增產物長度 171 bp;內參照 GAPDH:上游:5′CCACCACCATCTTCCAGGAG3′，下 游:5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′，擴增產物長度572 bp。用 Trizol試劑盒 (上海生工生物公司)提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)進行逆轉錄合成cDNA;以GAPDH為內對照，進行半定量逆轉錄聚合酶鏈反應。反應條件為:94℃ 預變性3 min后，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共進行 30 次循環，最后72℃ 延伸5 min，4℃ 冷卻終止反應。以 GAPDH為內參照同時進行PCR。聚合酶鏈反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。用GDS8000凝膠掃描分析系統分別對CoⅣ和GAPDH進行吸光度掃描，計算出CoⅣ基因表達量與GAPDH基因表達量的比值。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，所有測定指標均采用±s表示，多組數據組間比較采用F檢驗和q檢驗，兩組數據比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內Mn－SOD活力和MDA含量及CoⅣ活性的影響 與青年組比較，老年組大鼠心肌線粒體內Mn－SOD的活性降低，CoⅣ活性降低，MDA含量增加;與老年組比較，用藥組Mn－SOD活性增加，CoⅣ活性增加，MDA含量降低。見表1。

2.2 白藜蘆醇對老年大鼠心肌COⅣmRNA水平影響 各組在分子量171 bp處均出現DNA條帶。與青年組(1.34±0.158)相比，老年組CoⅣmRNA水平(3.75±0.26)顯著升高(P＜0.05);用藥組(2.48±0.19)與老年組比較，CoⅣ mRNA表達減低(P＜0.05)，差異均有統計學意義。見圖1。

表1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影響( ± s，n=10)

表1 白藜蘆醇對大鼠心肌線粒體內Mn-SOD活力、MDA含量和CoⅣ活性的影響( ± s，n=10)

與老年組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.001

組別Mn－SOD 活性(U/mg)MDA(nmol/mg)CoⅣ活性(μmol·min－1·mg－1青年組 46.25±4.041) 63.38±5.041) 2468.58±405.342)老年組 20.47±2.18 95.74 ±8.36 937.56±248.99用藥組 43.69±3.821) 76.65±7.371) 1983.46±402.532)

圖1 白藜蘆醇對老年大鼠心肌CoⅣmRNA表達的影響

3 討論

近年的研究發現自由基引起的生物膜脂質過氧化與衰老密切相關。Mn－SOD是一種存在于細胞線粒體中的能夠清除超氧化物自由基的酶，但隨著年齡的增加，機體細胞內Mn－SOD活性減弱，由于抗氧化物質產生的減少，脂質過氧化中間產物MDA增加〔5〕，將導致機體衰老。本研究結果發現，與青年組比較，老年大鼠MDA含量增加，Mn－SOD活性減低。使用天然藥物白藜蘆醇后，能顯著提高老年大鼠心肌線粒體Mn－SOD活力，減低MDA含量，機制可能為:①白藜蘆醇具有抗氧化成分，可直接中和氧自由基，使 Mn－SOD消耗減少，活力上升;②白藜蘆醇可能具有刺激SOD活性的組分，使其活力增加;③白藜蘆醇有效的抗氧化成分直接抑制線粒體膜的脂質過氧化反應，使MDA含量降低。

線粒體內膜上的呼吸鏈通過生物氧化產生機體需要的能量。CoⅣ是呼吸鏈酶中的關鍵酶，其酶活性變化直接影響整個呼吸鏈的功能變化，CoⅣ又是最不穩定、最脆弱、最易受損的酶，尤其易受自由基氧化損傷，引起電子傳遞過程中電子漏失，電子傳遞效率下降，自由基產生增多，進一步影響呼吸鏈功能，使ATP合成進一步減少，最終造成不可逆的損傷〔6～9〕。本研究結果表明，老年大鼠的心肌線粒體CoⅣ活性降低，在給予白藜蘆醇后，酶復合物的活性有所提高。進一步分子生物學研究發現，老年大鼠CoⅣmRNA表達增加，白藜蘆醇干預后CoⅣmRNA表達降低，分析原因可能是為了維持機體正常代謝所需的能量，而產生更多的輔酶蛋白補充，從而刺激CoⅣ表達增加。

以上的研究提示，白藜蘆醇通過增強機體的抗氧化作用，減少氧化產物對輔酶功能的損傷，從而使輔酶活性提高，進而降低對CoⅣmRNA水平反饋調節，以維持線粒體功能，進而改善心肌的能量代謝。

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