HLA－DRB1 rs9269186，rs3135388 SNPs和環境因素與老年原發性高血壓左室重構的關聯性

蔡麗偉 孫艷伏 王桂茹 李 波 姜 晶 張 洪 陳 紅 丁艷華

(吉林大學白求恩第一臨床醫院，吉林 長春 130021)

左室重構是原發性高血壓(EH)的主要靶器官損傷，主要表現為左室肥厚(LVH)和左室擴張(LVD)。左室重構嚴重影響心臟的收縮及舒張功能。有研究認為除外血流動力學的影響，仍有50%的左室重量變異無法解釋〔1〕，這都提示除高血壓外的其他因素參與心肌重構過程。研究表明一些非血流動力學因素參與心室重構的形成，其中包括年齡、性別、遺傳因素等〔2～6〕。人類白細胞抗原(HLA)基因即人類主要組織相容性復合體(MHC)是目前已知的最復雜的人類基因復合體，是群體遺傳學及免疫相關疾病研究的熱點〔7〕。早在1989年Dubov等〔8〕研究發現 LVH患者的 HLA－DR1和 DR4抗原含量較無LVH 的患者明顯增加。隨后 Emmanuel、Vlachonikolis 等〔9，10〕，研究認為HLA－DR11可能與LVH有關聯，但這種關聯性只表現在高血壓?、颉蠹壍幕颊?，因此推測HLA與動脈血壓水平有關;HLA－DQ7，DR17則與血管壁增厚有關，而且該關聯性獨立于血壓及血脂水平。HLA分布具有明顯的人種、民族、地理差別，從而導致與LVH相關的HLA基因、抗原的型別不同。本實驗擬通過對漢族老年EH患者左室重構相關環境因素和遺傳因素進行研究，以期確定高危人群，為人群高血壓及左室重構防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 2009年5月至2009年8月來我院高干病房體檢中心進行健康體檢的60歲以上EH患者，經知情同意說明后，共計148例患者同意參加本研究。

1.1.2 納入及排除標準 依據2005年中國高血壓防治指南推薦標準，在未服用降壓藥物的情況下，2次或2次以上非同日多次血壓測定所得的平均值，收縮壓(SBP)≥140 mmHg或/和舒張壓(DBP)≥90 mmHg，排除繼發性高血壓后，診斷為EH〔11〕。排除繼發性高血壓、甲狀腺功能亢進、先天性心臟病、風濕性心臟病及心臟瓣膜病變患者;并排除癱瘓、生活不能自理的患者。

1.1.3 分組 (1)按照LVH診斷標準〔12〕，左室心肌重量指數(LVMI) ≥125 g/m2(男)，LVMI≥110 g/m2(女)，將 148 例患者分為伴有 LVH(EH－LVH+)組 51人，不伴有 LVH(EHLVH－)組92人;(2)根據超聲結果，左室舒張末徑(LVDd)男性≥55 mm，女性≥50 mm為 LVD，EH伴有 LVD組(EHLVD+)15人，不伴有 LVD(EH－LVD－)組133人;(3)LVMI經身高校正(LVM/h)〔9〕后分組，LVM/h≤110 為組 1，52 人;110～150為組2，64人;LVM/h＞150為組3，27人(5人未測定身高、體重、未能分組)。

1.2 研究方法

1.2.1 個人及臨床信息 對EH患者常規詢問病史及體格檢查，獲取性別(SEX)、年齡(AGE)、身高、體重、腰圍(WL)、腹圍(AC)、高血壓家族史、病程(Course)、最高DBP及最高SBP，計算體重指數(BMI)，并采血檢查空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、肌酐清除率(Ccr)等。

1.2.2 LVH和LVD的測定 采用美國惠普5500型彩色多普勒心臟超聲診斷儀，根據美國超聲心動圖(UCG)協會提出的標準，測量三個心動周期的LVDd、舒張末期室間隔厚度(IVST)、舒張末期左室后壁厚度(PWT)，分別取其平均值。以Devereux校正公式〔13〕計算左心室重量(LVM)，LVM=0.8 ×1.04〔(LVDd+IVST+PWT)3－LVDd3〕+0.6;LVMI=LVM/BSA〔14〕，體表面積(BSA)=〔0.006 × 身高(cm)+0.0128 × 體重(kg)〕－0.1529。

1.2.3 HLA－DRB1單核苷酸多態性(SNP)位點的測定 (1)DNA提取，采外周血4 ml，分裝、－80℃冰箱凍存，采用Promega純化試劑盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。(2)引物序列見表1。(3)PCR－DNA連接酶檢測反應(LDR)技術檢測 SNPs:20 μl PCR 體 系:1 × Buffer，3 mmol/L Mg2+，每 個 dNTP 2 mmol/L，1 U Taq E，1 × Q－solution，0.2 pmol/L 引物混合物，50 ng DNA。PCR擴增條件:95℃變性15 min，35個循環，每個循環有 3 個溫度，94℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，最后在 72℃延伸 7 min。10 μl LDR 體 系:1 × Buffer，探 針 混 合 物12.5 pmol/L/每個，2 U Ligation E，PCR 產物 100 ng/μl。LDR條件:95℃變性2 min，30個循環，每個循環有2個溫度，94℃30 s，50℃2 min。(4)上述產物應用377DNA測序電泳儀測序。

1.3 數據處理及統計學分析 運用SAS8.0統計軟件，采用Epidata3.0建立數據庫，各臨床參數均用中位數、最大值、最小值表示，并采用非參數檢驗(wilcoxon秩和檢驗)進行組間比較。用擬合優度檢驗確定基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律。SNPs基因型及等位基因頻率分布采用χ2檢驗(Fisher′s精確概率法)，非條件多因素Logistic回歸分析計算比值比和95%可信區間。

2 結果

2.1 左室重構患病率 入組EH患者148例。根據超聲心動圖公式法檢出LVH者51例(男/女=48/3)，無LVH者92例(男/女 =87/5)。本研究中 EH患者 LVH的現患率為35.66%。LVD 15例(男/女 =14/1)，非 LVD 133例(男/女 =126/7)。EH患者伴有LVH和/或LVD者共55例，占EH患者37.16%。

2.2 HLA－DRB1 rs9269186及rs3135388 LDR圖譜 rs9269186位點呈C/G二態性，群體表現為C/C、C/G和G/G三種不同的基因型。rs3135388位點呈C/T二態性，群體表現為C/C和C/T兩種不同的基因型。見圖1。

圖1 HLA-DRB1 rs9269186、rs3135388 LDR 圖譜

2.3 EH伴有LVH組與不伴有LVH組結果比較

2.3.1 EH－LVH+組與 EH－LVH－組臨床特點比較 wilcoxon秩和檢驗結果發現，各相關因素在EH－LVH－組和EH－LVH+組之間均無統計學意義(P＞0.05)。

2.3.2 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗 對EH－LVH－組及EHLVH+組基因型頻數分布分別進行擬合優度χ2檢驗。結果表明，兩個SNP位點在各組中的基因型及等位基因頻數分布均符合H－W遺傳平衡定律(P＞0.05)。

2.3.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因頻數分布與LVH關聯性分析 經統計分析發現，rs9269186及rs3135388位點在EH－LVH+組及EH－LVH－組間基因型及等位基因頻率分布均無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 引物序列

2.4 EH伴有LVD組與不伴有LVD組結果比較

2.4.1 EH－LVD－組與 EH－LVD+組臨床特點比較 wilcoxon秩和檢驗結果發現，EH－LVD+組WL及 AC均高于 EH－LVD－組，且差異有統計學意義(P＜0.05)。其余指標在兩組間均無統計學差異(P＞0.05)。見表3。

2.4.2 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗 對EH－LVD－組及EHLVD+組兩個SNP基因型頻數分布分別進行擬合優度χ2檢驗得知，rs9269186及rs3135388基因型及等位基因頻率均符合H－W遺傳平衡定律(P＞0.05)。

表2 HLA-DRB1 SNPs基因型及等位基因頻數分布與LVH關聯性分析〔n(%)〕

表3 EH-LVD－組及EH-LVD+組臨床特點比較〔中位數(最小值、最大值)〕

2.4.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因頻數分布與LVD關聯性分析 rs9269186及 rs3135388位點在 EH－LVD+組及EH－LVD－組間基因型及等位基因頻率分布均無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

2.4.4 各危險因素分層后回歸分析與左室擴張的相關性 引入單因素分析中有意義的2個變量(WL及AC)進行非條件Logistic回歸分析，結果表明，WL、AL與LVD相關聯，P值分別是0.0244、0.0316，OR 值分別是 3.859(95%CI:2.232 ～64.157)、2.314(95%CI:1.154～11.234)。所以，WL、AC 可能是EH患者并發LVD的危險因素。

2.5 LVM/h分組分析結果

2.5.1 按LVM與身高比值(LVM/h)分組后各組臨床特點比較 經 wilcoxon秩和檢驗結果發現，BMI及WL和AC均隨LVM/h值增高而呈現增高的趨勢，且在LVM/h各組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)。其余各指標在LVM/h各組間均無統計學差異(P＞0.05)。見表5。

表4 HLA-DRB1 SNPs基因型及等位基因頻數分布與LVD關聯性分析〔n(%)〕

表5 按LVM/h分組后各組臨床特點比較〔中位數(最小值，最大值)〕

2.5.2 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗 對組1～組3兩個SNP基因型頻數分布分別進行擬合優度χ2檢驗，得知其基因型及等位基因頻率均符合H－W遺傳平衡定律(P＞0.05)。

2.5.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因頻數分布與LVM/h各組間關聯性分析 rs9269186及rs3135388位點在LVM/h各組間基因型及等位基因頻率分布均無統計學意義(P＞0.05)。見表6。

2.5.4 各危險因素分層后回歸分析與LVM/h各組的相關性引入單因素分析中有意義的3個變量(BMI、WL及AC)進行多因素非條件Logistic回歸分析，結果表明:AC和BIM的OR值分別為2.936和2.417(P＜0.05)，AC和BMI是EH－LVH的危險因素。見表7。

表6 HLA-PRB1 SNPs等位基因及基因型頻數分布與LVM/h關聯性分析〔n(%)〕

表7 多因素非條件Logistic回歸分析與LVM/h各組的相關性

3 討論

心臟是EH最常見的靶器官損傷之一，主要表現為LVH和LVD。LVH既是高血壓和心血管疾病的靶器官損傷，又是心血管事件和全病因死亡的獨立危險因素及預測因子〔15〕。研究發現，輕度高血壓患者中，LVH者占20%;嚴重高血壓患者中，LVH者占50%〔16〕，148例研究對象中左室重構以LVH為主，該研究人群LVH的現患率高達35.66%。而LVH和/或LVD者共55人，占EH患者37.16%。盡管LVH的發病機制還沒有完全弄清楚，但是研究認為一些血流動力學和非血流動力學因素與 LVH 相關〔17〕。

流行病學調查認為年齡是LVH發展的一個非常重要的危險因素〔18〕。研究認為年齡是LVH的獨立危險因素〔19〕，單因素分析未發現年齡與LVM定義的LVH的關聯;但進一步以LVM/h為觀察指標，發現隨著年齡的增高，LVM/h比值亦呈增高趨勢，但差異無統計學意義。有研究認為年齡增加對LVH的影響是通過成纖維細胞生長因子的表達來實現的〔20〕。Phyllis〔21〕等通過對7～18歲青少年EH患者的左室幾何構型的研究發現，SBP和BMI是LVH的影響因素，但是離心性LVH患者伴有更高的DBP。由此考慮不同年齡段的EH患者LVH的影響因素可能不同，老年人EH靶器官損傷的影響因素有待進一步研究。

除年齡因素外，許多其他環境因素對LVH的影響也引起了注意。Rodrigues等對682例患者進行4種肥胖指數測定，其中包括BMI、WL、AC和WL/h。研究發現WL/h是除腰臀比外，其他三項測定指標中最顯著的預測因子，且不受性別的影響。認為由WL/h測定的腹型肥胖，而不是全身肥胖，是女性LVH較好的預測因子〔22〕。另外研究〔23〕認為高血壓病程是EH伴LVH的危險因素，發現EH－LVH+組患者的BMI、WL/AC及EH病程均較EH－LVH－組高，但是無統計學差異。故根據Emmanuel等的研究方法〔9〕，將LVM用身高校正，即LVM/h，根據LVM/h值分組后進行單因素分析，結果發現BMI、WL及AC與LVM/h相關(P＜0.05)，進一步將上述單因素分析中有意義的變量進行多因素非條件Logistic回歸分析，發現BMI及 AC的 OR值均＞1，95%可信區間不包括1，所以認為BMI、WL及AC可能均是LVH的危險因素。研究表明性別、糖尿病、代謝綜合征、陳舊性心肌梗死(MI)、主動脈硬化和心臟瓣膜反流性疾病均和LVH 相關〔24～28〕，而未發現性別、FPG、TG、TC、HDL－C、LDL－C 在EH－LVH－組和 EH－LVH+組之間或 LVM/h分組之間的差異。Hyper〔29〕研究認為代謝危險因素(肥胖、糖尿病和高膽固醇血癥)一起作用時伴有更明顯的LVH及更高的LVH發病率。本研究未發現上述指標在兩組之間的差異有統計學意義。Sharma等〔30〕認為碳水化合物和高脂飲食能夠影響心臟生長代謝及心臟功能，碳水化合物和高脂飲食對LVH的病理過程有潛在的影響。Drazner等〔31〕研究認為高鹽飲食(獨立于高血壓的影響)者和工作壓力大的人均具有較高的LVH發病率。

無論在人類還是在動物模型的研究均發現，高血壓本身只能解釋部分心臟指數改變的原因，其余高達60%的原因歸咎于基因因素。HLA所在6號染色體區域是基因豐富、高選擇性區域。該區域的連鎖平衡不穩定模式及等位基因頻率在不同地理人群中可以很好地鑒定，所以成為群體遺傳學疾病研究的熱點。早在1989年Dubov等就已經開始研究HLA與LVH之間的相關性，并發現LVH患者的HLA－DR1和DR4抗原含量較無LVH的患者明顯增加〔15〕。2001年Emmanuel等對158例新發EH的雅典人研究HLA抗原是否是心血管重構的危險因素之一。他們通過超聲測定LVM、頸動脈內膜中層厚度(IMT)，其中LVM用身高校正，即LVM/h，并應用PCR技術測定HLA基因的表型。結果發現攜帶HLA－Ⅱ類抗原特異性DQ7、DR11的EH患者LVM/h高于非攜帶者;而攜帶HLA－B51的EH患者LVM/h低于非攜帶者;從而認為HLA－DQ7、DR11可能是LVH的易感基因，而HLA－B51可能是抵抗基因，具有一定的保護作用，推測某種HLA表型可能與EH－LVH有關聯〔16〕。隨后 Vlachonikolis等對雅典同種族的希臘人進行相關研究，應用方法與Emmanuel等方法相似。結果發現攜帶HLA－DR11的EH 2級或3級組LVM/h高于非攜帶者。這就再次證明HLA－DR1l可能是LVH的易感基因。但是這種關聯性在血壓正常組及輕度高血壓組之間并未發現。推測HLA與動脈血壓水平有關。即只有暴露于較高的血壓水平時HLA才可以作為心血管重構的促進因子。

基于上述研究，本研究假定HLA－DRB1與EH左室重構相關。選定HLA－DRB1的2個SNPs位點(rs9269186、rs3135388)，通過多重PCR－LDR技術測定，擴增出包含SNPs位點的基因片段，再通過DNA電泳測定相應位點堿基多態性，最后統計分析該位點是否與左室重構相關，從而驗證假設。但是研究結果未發現上述兩個多態位點與左室重構相關聯，一方面可能由于樣本數量小，沒有足夠的檢驗效能，檢出有意義的差異;另一方面由于在不同人群、地區、種族存在遺傳異質性，也可降低檢測疾病與某一特異SNPs之間關聯研究的統計效力。因此，應進一步擴大樣本數量，在不同的人群中對HLA－DRB1基因的其他SNPs位點與EH左室重構的關系進行研究。

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