MTHFR基因多態性與腦卒中的相關性

張海洋 張金華 張會敏 (新鄉醫學院第一附屬醫院小兒外科，河南 衛輝 45300)

腦卒中是遺傳因素和環境因素共同引起的一種疾病，為人類疾病的三大死因之一，其病因學研究及防治成為研究熱點。近年來研究發現腦梗死的發生與高同型半胱氨酸(Hcy)血癥關系密切〔1〕，N5，N10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是 Hcy代謝的關鍵酶之一，MTHFR基因突變導致酶活性下降，使血漿Hcy濃度升高及DNA低甲基化〔2〕，從而造成一系列病理改變，引發多種疾病。目前研究較多的是MTHFR基因突變為C677 T點突變，其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大并且其多態性與腦卒中的關系目前國內外研究還存在爭議〔3〕。本研究分析冠心病和與之年齡及性別匹配的對照人群的MTHFR基因C677 T多態性，探討二者的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 2008年1月至2009年12月我院住院腦卒中患者151例，選取年齡、性別相匹配的151例同期住院患其他疾病患者或體檢中心健康志愿者作為對照組。腦卒中組患者經過頭顱MRI和(或)CT掃描明確診斷，符合1996年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準，并排除腦出血和占位性病變。對照組均無冠心病和腦血管病史。腦卒中組平均年齡(65.8±9.25)歲，男89例;對照組平均年齡(65.1±11.34)歲，男85例。兩組在性別、年齡方面無顯著差異(P＞0.05)，兩組均進行血糖、血脂、Hcy等檢測。

1.2 DNA的提取和濃度測定 抽取患者空腹外周靜脈血4 ml于EDTA抗凝管中，存放于－20℃冰箱。集中提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(購于德國BMS公司)提取DNA后，存放于－20℃冰箱。用核酸蛋白濃度測定儀測定抽提基因組DNA濃度，并將保存的基因組模板DNA原液用DNA溶解液稀釋(GENTRA公司Puregene試劑盒)至終濃度5～10 ng/μl。

1.3 MTHFR基因型測定 采用聚合酶鏈式反應限制性酶切片段長度多態性(PCR－RFLP)分析法，擴增引物序列如下:上游5′－CAAAGGCCACCCCGAAGC－3′和下游 5′－AGGACGGTGCGGTGAGAGTG－3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系 25 μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200 μmol/L、正反引物各 0.5 μmol/L、TaqDNA 聚合酶2 U、模板 DNA 5 μg。PCR 擴增條件如下:94℃5 min，94℃30 s，56℃40 s，72℃40 s，35 個循環，末次延伸7 min;取8 μl PCR反應產物，加4 U限制性內切酶HinfⅠ，反應體積 20 μl，酶切 4 h。取 8 μl酶切產物，12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，溴乙啶(EB)染色30 min，UVP凝膠成像系統攝像判斷基因型。

1.4 Hcy測定 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者清晨空腹靜脈血10 ml分離血漿后立即 －20℃凍存，1 w內轉移入－80℃凍存，應用高效液相色譜(HPLC)法測定血液中Hcy:采用Agilent1100液相色譜儀，色譜柱為 HypersilC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為0.04 mol/L醋酸緩沖液，流速0.8 ml/min;進樣量20 μl;柱溫25℃;分析時間15 min;熒光檢測條件:激發波長382 nm，發射波長470 nm。樣本兩次測定值誤差不超過15%。Hcy正常值設定在＜10 μmol/L，超過10 μmol/L定義為高 Hcy 血癥(HHcy)〔2〕。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行計量資料非配對t檢驗及方差分析、計數資料Hardy－Weinberg平衡χ2檢驗。

2 結果

2.1 兩組平均血漿Hcy濃度比較 腦卒中組血漿Hcy濃度〔(24.69 ± 4.32)μmol/L〕明 顯 高 于 對 照 組 〔(8.98±2.79)μmol/L〕(t=7.112，P ＜0.001)。

2.2 兩組MTHFR基因型和等位基因頻率比較 PCR擴增產物片段為246 bp，HinfⅠ酶切結果顯示MTHFR基因型有3種，分別為野生型(C/C)、雜合子型(C/T)、純合子突變型(T/T)，包含C等位基因的246 bp片段不被HinfⅠ酶切，含T等位基因的片段被HinfⅠ酶切為175和198 bp兩個片段(圖1)。腦卒中組MTHFR(C677 T)C/C、T/T基因型頻率和C、T等位基因頻率明顯低于對照組(P＜0.05)(表1)。

圖1 PCR-RFLP電泳結果

表1 兩組MTHFR(C677 T)基因型和等位基因頻率〔n(%)，n=151〕

3 討論

Hcy已被證實是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，而MTHFR是Hcy代謝中的關鍵酶。對MTHFR基因多態性的研究多集中在C677 T位點。研究表明，MTHFR基因cDNA序列上第677位核苷酸C→T突變，產生一個HinfⅠ限制性內切酶識別序列，變化的結果使編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，從而造成MTHFR活性及耐熱性降低，使催化N5，N10－亞甲基四氫葉酸反應并提供甲基給Hcy進行轉甲基代謝的能力下降，導致Hcy代謝障礙，最終血漿中Hcy水平增高〔4〕。

缺血性腦卒中包括腦血栓形成、腔隙性梗死和腦梗死等，是指因腦部血液循環障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織的缺血性壞死和軟化，并出現偏癱、偏身感覺障礙、偏盲、言語障礙、眩暈、吞咽困難、共濟失調等一系列局灶性神經功能缺損癥狀和體征〔5〕。發病原因很復雜，是很多因素作用的結果，流行病學和動物模型均表明腦梗死是遺傳性疾病，有關腦梗死基因多態性的研究也涉及炎癥細胞因子基因、載脂蛋白基因、血管緊張素轉換酶基因、血漿纖維蛋白原因子、一氧化氮合酶、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白3(ERPINA3)、環氧合酶－2(COX－2)基因、MTHFR等〔6〕。其中MTHFR是研究熱點，但國內外研究結果并不一致，Cronin等〔7〕認為MTHFR基因多態位點的不同是意大利人腦梗死的危險因素，而Szolnoki等〔8〕在匈牙利人群發現MTHFR基因型的C677 T變異與急性腦梗死無相關性。邵燕等認為高Hcy血癥是腦梗死的獨立危險因素，單純的MTHFR C667 T突變既不能產生高Hcy血癥，也不能被確定為老年腦梗死的獨立危險因素〔9〕。本結果結果提示C677 T突變與河南豫北地區漢族人群腦梗死發生有著密切關系，可能是其發病的遺傳危險因素之一，同時腦卒中組血漿Hcy升高可能與MTHFR基因位點突變有關。上述各研究結果間存在差異，可能與種族不同、地域不同、樣本大小不同有關以及基因與基因間、基因與環境間的相互作用不同有關。總之，MTHFR基因C677 T多態性與腦梗死的確切關系有待擴大樣本量深入研究。

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3 Trabetti E.Homocysteine，MTHFR gene polymorphisms，and cardio cerebrovascular risk〔J〕.J Appl Genet，2008;49(3):267－82.

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6 李 靜，楊文明.腦梗死致病基因多態性熱點研究〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2011;9(6):740－3.

7 Cronin S，Furie KL，Kelly PJ.Dose related association of MTHFR C677T allele with risk of ischemic stroke:evidence from accumulative meta analysis〔J〕.Stroke，2005;36(7):1581－7.

8 Szolnoki Z，Somogyvari F，Szabo M，et al.Interactions between the MTHFR C677T and MTHFR A1298C mutations in ischemic stroke〔J〕.Ideggyogy Sz，2006;59(34):107－12.

9 邵 燕，章成國，胡學強.血漿同型半胱氨酸及其酶基因多態性與老年腦梗死的關系〔J〕.臨床神經病學雜志，2006;19(1):22－4.