非小細胞肺癌組織BAG－1和Caspase－3基因的表達及其關系

黃 凱 崔廣暉 趙 松 李瑋浩 (鄭州大學第一附屬醫院胸外科，河南 鄭州 450052)

肺癌是最常見的原發惡性腫瘤，是一種嚴重威脅人類健康的常見病。許多研究發現細胞凋亡失衡在腫瘤的發生、發展中也起著重要作用。Bcl－2結合抗凋亡基因－1(BAG－1)是20世紀90年代初發現的一種抗凋亡基因，其編碼的蛋白是一種多功能結合蛋白，具有增強腫瘤細胞抗凋亡的能力。BAG－1基因在肺癌的發生、發展中的作用及機制并未完全明確。本研究采用免疫組化方法研究非小細胞肺癌(NSCLC)組織細胞中BAG－1基因和Caspase－3基因的表達及其相互關系，探討BAG－1基因和Caspase－3基因在肺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 我科手術切除的NSCLC組織標本75例，其中男54例，女21例，年齡31～76歲，平均52.3歲。所有病人術前均未接受過化療和放療。經病理學檢查證實為肺癌，其中鱗癌43例，腺癌32例;低分化31例，中分化和高分化癌44例。根據國際抗癌聯盟2009年修訂的肺癌分期標準:Ⅰ期+Ⅱ期40例，Ⅲ期+Ⅳ期35例;伴有淋巴結轉移者52例，無淋巴結轉移者23例。

1.2 主要實驗試劑 兔抗人 BAG－1多克隆抗體、鼠抗人Caspase－3單克隆抗體抗體均購于上海威奧生物科技有限公司，多聚賴氨酸玻片處理劑購于武漢博士得生物工程公司。

1.3 方法 石蠟標本制成3 μm厚的切片。常規脫蠟，梯度乙醇脫水，微波抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷15 min，分別滴加BAG－1多克隆抗體(1∶125)和 Caspase－3單克隆抗體(1∶100)，置27℃孵育60 min，Ⅱ抗37℃孵育 30 min，Ⅲ抗 37℃孵育30 min，DAB顯色4～8 min，蘇木精復染后，脫水、透明、封固后光鏡下觀察。用已知的陽性切片染色作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組化陽性細胞的觀察和圖像分析 采用半定量方法測定 BAG－1、Caspase－3 基因表達〔1〕。選取5 個高倍鏡視野(200倍)計數1000個腫瘤細胞中BAG－1、Caspase－3表達陽性細胞數，分為以下4個等級:0級≤5%，5% ＜1級≤25%，26% ＜2級 ＜60%，3級 ＞60%。根據 BAG－1、Caspase－3免疫組化染色的強度分成以下3個等級:弱陽性(顯色淡黃或僅個別細胞呈黃至棕黃色染色)=1;中等陽性(顯色強度介于弱陽性與強陽性之間)=2;強陽性(多數細胞呈棕黃至棕褐色染色)=3;以陽性細胞數分值與染色強度分值的乘積為每例患者的積分，積分0～1分為表達陰性(－)，2～3分為表達弱陽性(+)，4～6分為表達中度陽性，＞6分為表達強陽性。弱陽性歸為陰性表達。1.5 統計學分析 計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 BAG－1基因在NSCLC組織細胞中的表達及其與臨床病理特征的關系 免疫組化結果表明，BAG－1陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于胞漿中，在胞核中也有少量存在。74例NSCLC中，BAG－1基因的表達率為64.0%(48/75)，其表達與NSCLC細胞分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P＜0.05)。見表1。

表1 BAG-1基因及Caspase-3基因陽性表達與臨床病理特征的關系

2.2 Caspase－3基因在NSCLC組織細胞中的表達及與臨床病理特征的關系 免疫組化檢測結果表明，Caspase－3陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于胞漿中。74例NSCLC組織細胞中Caspase－3基因的表達率為57.3%(43/75)，其表達與NSCLC病人淋巴結轉移有密切關系(χ2=5.96，P＜0.05)。見表1。

2.3 BAG－1與 Caspase－3基因在 NSCLC中表達的關系 在NSCLC組織細胞中，BAG－1基因表達與Caspase－3基因表達呈高度正相關(r=0.436，P ＜0.01)。

3 討論

BAG－1是共輔助分子家族成員，最早是作為Bcl－2結合蛋白而被發現的，其不僅有獨立地抗凋亡作用而且可以增強Bcl－2的抗凋亡活性，同時可以和HSC/HSP70、RA F21、核激素受體等多種靶分子相互作用而調節細胞增殖、轉錄、轉移和移動性〔1〕，從而使BAG－1通過多種途徑在腫瘤的發生進展中發揮重要作用，同時可間接反映腫瘤細胞對治療的反應。BAG－1在大部分正常人體組織中呈微弱表達或不表達，但在大多數腫瘤細胞系均有表達，提示 BAG－1與多種腫瘤的發生、發展有關〔2～4〕。本研究結果顯示，BAG－1表達與腫瘤 TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移相關，而與組織細胞類型、年齡、性別無明顯相關。說明BAG－1的存在預示腫瘤有較高的侵襲性與不良預后，其機制可能是由于BAG－1與抑制腫瘤細胞的凋亡有關。

Caspase－3主要是降解多 ADP－核糖多聚合成酶(Poly－PARP)及UI小核核糖核蛋白。PARP的降解可導致核內核酸酶的激活，使核小體間DNA鏈水解斷裂，產生凋亡所特有的DNA節段化。目前已公認:在多種刺激引起的凋亡中Caspase－3是關鍵的效應分子〔5〕。本研究結果表明，Caspase－3基因在NSCLC中的低表達抑制了腫瘤細胞的凋亡，促進了腫瘤細胞的生長，在NSCLC的發生發展中可能起重要的作用。但在本研究中Caspase－3基因的表達與NSCLC組織類型、分化程度、TNM分期無關。

本研究顯示，Caspase－3基因的表達與BAG－1基因表達具有顯著負相關性。可以認為，Caspase－3和BAG－1可能共同參與肺細胞凋亡過程的調節，即Caspase－3基因的低表達有助于NSCLC的發生，BAG－1作為一種凋亡抑制蛋白在NSCLC中能夠減低 Caspase－3介導的細胞凋亡作用。Caspase－3基因和BAG－1基因表達的關系對NSCLC發生、發展起著重要作用。

1 Sharp A，Cutress RI，Johnson PW，et al.Short peptides derived from the BAG－1 C－terminus inhibit the interaction between BAG－1 and HSC70 and decrease breast cancer cell growth〔J〕.FEBS Lett，2009;583(21):3405－11.

2 Alper M，Cukur S，Belenli O，et al.Evaluation of the immunohistochemical stain patterns of survivin，Bak and Bag－1 in colorectal cancers and comparison with polyps situated in the colon〔J〕.Hepatogastroenterology，2008;55(85):1269－73.

3 Wood J，Lee SS，Hague A.Bag－1 proteins in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2009;45(2):94－102.

4 Liu HY，Wang ZM，Bai Y，et al.Different BAG－1 isoforms have distinct functions in modulating chemotherapeutic－induced apoptosis in breast cancer cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2009;30(2):235－41.

5 Hunter AM，LaCasse EC，Korneluk RG.The inhibitors of apoptosis as cancer targets〔J〕.Apoptosis，2007;12(9):1543－68.