乳病消片定性鑒別及其延胡索乙素的含量測(cè)定

宋三孔，宋 霞，楊效宇，焦海勝

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730030)

乳病消片為蘭州大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)院制劑，由柴胡、丹參、元胡、當(dāng)歸、淫羊藿、黃芪、茯苓等多種藥材組成，具有疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，在醫(yī)院已使用30余年，主要用于治療乳腺炎、乳腺增生等。本試驗(yàn)中采用薄層色譜(TLC)法對(duì)處方中黃芪、淫羊藿、茯苓等藥材進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定處方中元胡藥材延胡索乙素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，包括G1312A二元泵，G1315B二極管陣列檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，G2170AA色譜工作站;ME2325S型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);HPD－25型真空泵(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);ZF－C型三用紫外分析儀(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司);CQ50型超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)為 110726－200409)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)為110737－200312)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)為 110781－200512)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;硅膠G、H薄層板(青島海洋化工廠);甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;元胡、淫羊藿、黃芪、茯苓等藥材購(gòu)自甘肅方正醫(yī)藥有限公司，均符合2010年版《中國(guó)藥典(一部)》規(guī)定;乳病消片按蘭州大學(xué)第二醫(yī)院制劑室工藝自制(批號(hào)分別為 20101010，20101011，20101012)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別(薄層色譜法)

2.1.1 淫羊藿[1]

取本品 10片，研細(xì)，稱取1.0 g，加70%乙醇 10 mL，超聲處理30 min后過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解混勻，作為供試品溶液。稱取淫羊藿苷對(duì)照品用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的對(duì)照品溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺淫羊藿的陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，用乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(10∶1∶1 ∶1)為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜在相應(yīng)位置上顯相同的暗紅色斑點(diǎn);噴三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同橙紅色熒光斑點(diǎn)。而陰性對(duì)照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1A)。

2.1.2 黃芪[2]

取本品 10片，研細(xì)，稱取 2.0 g，加乙醇 30 mL，加熱回流30 min后過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液15 mL使之充分溶解，過濾，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至5，每次用乙酸乙酯15 mL振搖萃取3次，取出乙酸乙酯層溶液，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙過濾，濾液用水浴蒸干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯溶解混勻，作為供試品溶液。稱取黃芪甲苷對(duì)照品，用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為1 g/L的對(duì)照品溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(10∶1)為展開劑展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰后，在紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液色譜在相應(yīng)位置上顯相同黃色熒光主斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1B)。

2.1.3 茯苓[2]

取本品10片，研細(xì)，稱取2.0 g，加乙醚50 mL，超聲處理10 min后過濾，濾液用水浴緩慢蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解混勻，作為供試品溶液。稱取茯苓對(duì)照藥材1.0 g，按供試品溶液制備方法制成茯苓對(duì)照藥材溶液。另按處方制備工藝及供試品溶液制備方法制成缺茯苓的陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用甲苯－乙酸乙酯－甲酸(20∶5∶0.5)作為展開劑展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸－乙醇(4∶1)混合溶液，在105℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜在相應(yīng)位置上色譜顯相同顏色主斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜無此斑點(diǎn)(圖1C)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 延胡索乙素含量測(cè)定(高效液相色譜法)

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Luna C18柱(25 mm ×4.60 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào) pH 至 6.5，70 ∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)大于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取對(duì)照品1.44 mg，加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素0.144 mg的對(duì)照品溶液。取本品20片，研細(xì)，精密稱取3.0 g，置燒瓶中，再精密加濃氨試液－甲醇(1∶20)混合溶液50 mL，稱重，冷浸和加熱回流依次各1 h，放冷，再次稱重，用濃氨試液－甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足減失量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，用水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，用0.22 μm有機(jī)膜過濾，并取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方制備工藝制成缺延胡索的陰性對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備延胡索陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):將2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣20 μL，色譜圖見圖2。可知，延胡索乙素在280 nm波長(zhǎng)處無雜質(zhì)干擾。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成 7.2，14.4，28.8，43.2，57.6，72.0，86.4 μg/mL系列質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣 20 μL，以延胡索乙素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) X、峰面積為縱坐標(biāo) Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=13.306 X －42.152，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，延胡索乙素進(jìn)樣量在0.144～1.728 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液20 μL，按擬訂的色譜條件，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣 1 次，測(cè)定延胡索乙素的峰面積。結(jié)果的 RSD為1.42%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定延胡索乙素的峰面積。結(jié)果的 RSD為0.97%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一批樣品，依法制備供試品溶液6份，精密吸取20 μL進(jìn)樣。結(jié)果延胡索乙素平均含量為0.032 9 mg/g，RSD 為 1.03%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的樣品(含量為0.035 4 mg/g)約 2.0 g共 6 份，各加延胡索乙素對(duì)照品溶液(0.144 g/L)0.5，0.5，2.5，2.5，3.5，3.5 mL，按供試品溶液制備方法處理后，混勻，進(jìn)樣20 μL測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 延胡索乙素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批樣品，依法制備供試品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算延胡索乙素含量。結(jié)果批號(hào)為20101010，20101011，20101012的樣品中延胡索乙素含量分別為 0.032 2，0.035 4，0.036 0 mg/g(n=3)。

3 討論

曾用乙腈 －水(55∶45)、甲醇 －水(55∶45)、甲醇 －水(70∶30)作為流動(dòng)相，但分離度不好，對(duì)稱性差，有明顯的前沿峰，且理論板數(shù)不高;采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH至6.5，70∶30)為流動(dòng)相，上述問題均得以解決。故本試驗(yàn)采用甲醇－0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH至6.5，70∶30)為流動(dòng)相。

乳病消片由多種藥材組成，成分復(fù)雜，增加了其全面質(zhì)量控制的難度。關(guān)于其質(zhì)量控制方法，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，多為單藥材的高效液相色譜法含量測(cè)定，較零散單一。為了進(jìn)一步完善該處方片劑質(zhì)量控制，本試驗(yàn)建立了方中4種藥材的定性或定量分析方法，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。淫羊藿、茯苓藥材薄層色譜法鑒別方法可靠，斑點(diǎn)顯色明顯。黃芪薄層色譜鑒別用氨蒸氣熏蒸后斑點(diǎn)顯色不穩(wěn)定，影響重現(xiàn)性，故采用噴以10%硫酸乙醇溶液、105℃加熱后顯色，主斑點(diǎn)明顯而持久。

[1]劉玉成，孫長(zhǎng)文，楊紅玉，等.仙靈骨葆片的薄層色譜鑒別[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34(2):25－26.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:224，283 －284.