光照條件對叢枝菌根真菌吸收外源氮產精氨酸的影響

劉 潔，于向鵬，劉 靜，金海如

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

氮是自然界中重要的大量元素，植物需求量大，土壤供應量少，影響植物的生長和產量.給植物提供氮肥的方法包括化學施肥和生物施肥.氮的生物施肥是指利用根際細菌，包括固氮菌和根瘤菌，提高植物氮營養(yǎng).叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是一類內生菌根真菌，普遍存在于世界各地［1］，與90%的維管束植物形成共生關系［2］.

很多研究表明，AM真菌的根外菌絲(extraradical mycelium，ERM)可以從環(huán)境中吸收各種形態(tài)的氮源［3-4］.AM真菌將吸收的氮源在根外菌絲中整合入精氨酸，然后轉運到根內菌絲，在根內菌絲中降解，釋放出無機氮，用于其他氨基酸的合成或者傳遞給宿主植物利用［5］.因此，菌絲和菌根中精氨酸的含量直接反映了AM真菌對植物氮營養(yǎng)吸收的意義.光的質量、強度和光照時間對植物的生長發(fā)育有很大的影響.光照也影響菌根的形成.強光照下洋蔥接種球囊霉屬真菌，菌根發(fā)育良好，叢枝數(shù)量也較多［6］.光照也可以影響AM真菌的生長.AM真菌的氮代謝近年來研究得較為清晰，但是有關光照對AM真菌氮代謝的影響尚了解甚少.為此，筆者利用三室培養(yǎng)盒，在3種光照條件下，在菌絲室添加不同形態(tài)的外源氮，研究了不同光照條件對AM真菌吸收同化外源氮產生精氨酸的影響，分析了不同光照對AM真菌氮代謝的影響.

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試菌種為根內球囊霉菌(Glomus intraradices)，由浙江師范大學微生物與發(fā)酵工程實驗分室提供.宿主植物為高粱(Sorghum bicolor L.Moench，遼雜19號)，購自遼寧省東方農業(yè)科技有限公司.實驗所用的基質分為2種:育苗階段培養(yǎng)基質為蛭石;后期培養(yǎng)的基質為粒徑1～3 mm的河沙.培養(yǎng)容器:育苗階段使用培養(yǎng)杯;后期培養(yǎng)階段使用三室隔離培養(yǎng)盒.培養(yǎng)盒由白鐵皮做成，中間用雙層的38 μm的尼龍網和鐵絲網將培養(yǎng)盒分隔開，分別為菌根室、隔離室和菌絲室.菌根室大小為3 cm×10 cm×10 cm，菌絲室大小為5 cm×10 cm×13 cm(見圖1)，菌根室比菌絲室短3 cm.中間的隔離室只允許菌絲自由地通過，阻止植物根系通過，這樣既可減少養(yǎng)分在菌絲室和菌根室間的流動，也將菌絲和菌根分隔開.

圖1 三室隔離培養(yǎng)盒

選取顆粒飽滿的高粱種子，用10%H2O2溶液表面消毒，浸泡30 min，去離子水漂洗干凈，種在盛有滅菌蛭石的培養(yǎng)杯中，置于培養(yǎng)箱中育苗.

挑選長勢相同的苗移栽到菌根室.菌根室填滿直徑為1～3 mm的河沙，河沙經自來水反復沖洗至水澄清、蒸餾水漂洗干凈、1×105Pa滅菌2 h.同時在根部添加2.5 mL的菌劑，分別置于4 800 lx(40%)，13 200 lx(60%)和 17 600 lx(80%)的光照條件下培養(yǎng)，此期間每5 d加一次2 mL Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)30 d.再將菌絲室填滿滅菌的河沙，菌根室依舊每5 d添加一次2 mL Hoagland營養(yǎng)液，菌絲室只加水保持濕潤，培養(yǎng)10 d，檢測菌絲生長到菌絲室中，在菌絲室中添加4 mmol/L不同形式的氮源:精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、尿素(Urea)和NH4NO3溶液，每5 d加一次，一次3 mL.同時，菌絲室和菌根室都加Hoagland缺氮營養(yǎng)液，每次2 mL.每種氮源為一個處理組，菌絲室不加氮源為對照(CK)，設置3種光照強度，每組設置3個重復，共45盆(3×5×3)，培養(yǎng)40 d后收獲.

1.2 測定項目

高粱收獲后分別收集地上部和根系.根系用蒸餾水洗凈，均勻取樣，剪成1 cm左右的根段，采用曲利苯藍染色-方格交叉法測定根侵染率［7］.地上部分測量株高，挑選從上數(shù)第2片葉子測量葉綠素［8］，其余剪碎，與剩下的根一起冷凍干燥，備用.

從菌絲室均勻取50 g河沙，采用濕篩傾析技術進行孢子計數(shù)［7］.剩余的河沙采用同樣的技術將菌絲篩出來，用去離子水反復沖洗，收集到離心管中，-55℃，真空度10.5 Pa冷凍干燥，備用.

冷凍干燥后的樣品，取0.04 g根和5 mg根外菌絲，分別測定精氨酸含量.干燥后的莖葉0.1 g，加入消化劑消化，再用凱氏定氮儀測定其中的總氮含量.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用SAS系統(tǒng)進行方差分析和樣本平均數(shù)的顯著性差異分析.

2 結果

2.1 根外菌絲干質量、孢子數(shù)量和菌根侵染率

光照強度可以影響菌絲室中根外菌絲的干質量、孢子數(shù)量和根侵染率，80%光照的影響明顯高于60%和40%的光照.40%和60%光照對根外菌絲干質量的影響差距不大，但是不同氮源對根外菌絲干質量的影響趨勢是一樣的，都是以NH4NO3為外源氮時的根外菌絲干質量最大.80%光照條件下卻是谷氨酰胺(Gln)對根外菌絲的干質量影響最大，達到了35.37 mg.對孢子數(shù)量的影響是:在40%光照條件下，以NH4NO3為外源氮時，孢子產量高于其他外源氮;而在60%和80%光照條件下，谷氨酰胺和尿素為外源氮時的孢子產量較高.提高光照強度可以增加孢子的數(shù)量.菌絲室施加不同的外源氮對各種光照條件下根侵染率的影響不大(見表1).

表1 不同光照條件和不同形式外源氮對根外菌絲干質量、孢子數(shù)量和菌根侵染率的影響

2.2 植物株高和葉綠素含量

在3種光照條件下，60%光照下植物的株高和葉片葉綠素含量均高于其他2個光照條件;80%光照下植物長勢較矮，但是植株較粗壯，葉片葉綠素含量最低.NH4NO3為外源氮時，葉綠素含量最低;40%與60%光照下尿素為外源氮時，葉綠素含量最高;但80%光照下則是精氨酸為外源氮時葉綠素含量最高(見表2).

表2 不同光照條件和不同形式外源氮對AM真菌宿主植物葉綠素和株高的影響

2.3 莖葉中總氮含量

AM真菌從外界吸收外源氮轉運給植物［5］.外源氮的添加會對植物含氮量有一定的影響.由圖2可以看出:60%光照條件下，植物的含氮量比其他2個光照下有明顯的優(yōu)勢，尿素為外源氮時莖葉的氮含量最高，達到了29.96 g/kg;40%光照下也是尿素對植物總氮含量的影響最大，表現(xiàn)為Urea＞Gln＞Arg＞NH4NO3;而80%光照下植物的氮含量明顯低于其他2個光照下，大約只有其他2種光照下的1/3，而且菌絲室加不同外源氮之間也沒有顯著差異.

圖2 不同光照和氮源對莖葉中氮含量的影響

2.4 菌根和菌絲中精氨酸含量

圖3 不同光照和氮源對菌絲中精氨酸含量的影響

圖4 不同光照和氮源對菌根中精氨酸含量的影響

精氨酸是AM真菌氮轉運的有機氮載體，吸收的外源氮存儲于精氨酸中，再從根外菌絲輸送到根內菌絲中［9］.由圖3和圖4可以看出，菌根中的精氨酸含量明顯比根外菌絲中的高很多.60%光照下根外菌絲中精氨酸含量最高，40%光照下次之，80%光照下最低;60%光照和不同外源氮處理下，根外菌絲中精氨酸的含量不同，表現(xiàn)為Arg＞Gln＞Urea＞NH4NO3(見圖 3).但是，菌根中精氨酸含量受光照影響大小順序是80%＞60% ＞40%;80%光照下，不同形態(tài)的外源氮對菌根中精氨酸含量的影響為NH4NO3＞Gln＞Arg＞Urea(見圖4).

3 討 論

大量研究表明，磷元素營養(yǎng)與菌根形成的關系最為密切［10］，氮素營養(yǎng)也會影響AM真菌的生長［11］.本實驗固定了氮和磷的濃度，僅改變光照強度，發(fā)現(xiàn)不同的光照強度對AM真菌的生長也是有影響的.因為強光照可以促進植物的光合作用，植物光合的凈同化率提高，從而增加了根內碳水化合物如蔗糖等可溶性糖的含量，促進了植物新根的萌發(fā)和生長，因而有利于菌根的形成，最終促進了孢子和菌絲的生長.

3.1 不同光照和外源氮對AM真菌吸收外源氮產精氨酸的影響

本實驗中，同一處理下菌根中的精氨酸含量是菌絲中的幾倍.因為AM真菌可以吸收外源氮，在AM真菌中外源氮轉化為精氨酸，以精氨酸的形式運輸?shù)礁鶅染z中，在根內菌絲中積聚［5］.這就是菌根中精氨酸含量高于根外菌絲中的原因.在菌絲中，80%光照下的精氨酸含量最低;但在菌根中恰恰相反，80%光照下的精氨酸含量最高.60%光照下，菌絲中的精氨酸含量高于其他2個光照下的;但是菌根中精氨酸含量介于另2個光照的中間.可能是因為光照強度直接影響光合作用，強光照提高了光合作物的產量和速率，宿主植物將其光合作用產物向下傳遞給AM真菌［7］的量與速率也提高，根內菌絲中的碳骨架需要大量的精氨酸，進而促進根外菌絲吸收外源氮合成精氨酸并轉運到根內菌絲中，在根內菌絲中積累.光照越強，轉運速度越快.

在80%光照下，以NH4NO3為外源氮時，菌絲和菌根中精氨酸含量最高，這與報道的AM真菌優(yōu)先利用的結果相同.而精氨酸和谷氨酰胺為外源氮時，菌根和菌絲中精氨酸含量次之，高于尿素處理的.可能是因為雖然根外菌絲吸收精氨酸和谷氨酰胺需要消耗一定的能量，但是吸收后，精氨酸可以直接運輸?shù)礁鶅染z，谷氨酰胺也可以直接合成精氨酸后轉運到根內菌絲中.空白處理的精氨酸含量很低，表明了AM真菌的根外菌絲可以吸收不同的外源氮產生精氨酸.

在60%和40%光照條件下，以精氨酸和谷氨酰胺為外源氮時，菌絲和菌根中的精氨酸含量較高;而以尿素和NH4NO3處理時，精氨酸含量較低.這與文獻［12］報道的根外菌絲吸收NH+4比氨基酸的能力更強的結果不一致，與文獻［14］盆栽條件下的研究報道一致.這可能是因為培養(yǎng)的方式不同所致.本實驗采取的盆栽培養(yǎng)，處理時間較長，可能有微生物滋生.礦化作用使有機氮源降解成為易吸收的形式，這種形式可能處于NH+4同化為精氨酸之間的一種產物，既利于根外菌絲的吸收，又可以省略很多同化為精氨酸的步驟，加快了吸收同化的速率.

不同光照條件下菌絲和菌根中的精氨酸含量受氮源種類的影響，但是不同光照對不同氮源的影響不同，說明光照強度不僅可以影響AM真菌的生長繁殖，也可以影響共生體系對營養(yǎng)的吸收.

3.2 AM真菌促進植物氮吸收

有研究表明，AM真菌可以吸收氮素，并且向宿主植物傳遞［15］.本實驗中，空白處理的植物莖葉含氮量明顯低于其他菌絲室添加氮源的，也證實了這一點.60%和40%光照下，尿素為外源氮時，植物莖葉總氮含量最高.值得關注的是，80%光照條件下植物的總氮含量很低，大概是另外2種光照下的1/3，且各種氮源處理間沒有顯著差異.造成這種現(xiàn)象的原因，可能是光照較強時雖然影響了葉綠素的合成，但是光合作用產物較多，提供給菌根的碳骨架較多，在菌根內的精氨酸降解釋放出的NH+4都在菌根內合成其他的氨基酸，并沒有運輸?shù)街参矬w內，導致植物莖葉中含氮量低于其他2個光照下的.這也與80%光照下菌根中精氨酸含量很高相符.強光照雖然促進了AM真菌吸收同化外源氮產生精氨酸，但是卻抑制了AM真菌和宿主植物之間的氮轉移.所以，光照強度對AM真菌吸收氮元素的促進作用是在一定光照范圍之內的.光照強度對AM真菌促進植物氮吸收的影響不容忽視.

［1］李俠，張俊玲.叢枝菌根真菌對氮素的吸收作用和機制［J］.山西大同大學學報:自然科學版，2008，24(6):75-77.

［2］Smith S E，Read D J.Mycorrhizal symbiosis［M］.London:Academic Press，1997.

［3］Ames R N，Reid C P P，Porter L K，et al.Hyphal uptake and transport of nitrogen from two15N-labelled sources by Glomus mosseae，a vesiculararbuscular mycorrhizal fungus［J］.New Phytologist，1983，95(3):381-396.

［4］Fery B，Schüpp H.Acquisition of nitrogen by external hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi associated with Zea mays L［J］.New Phytologist，1993，124(2):221-230.

［5］Jin H，Pfeffer P E，Douds D D，et al.The uptake，metabolism，transport and transfer of nitrogen in an arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］.New Phytologist，2005，168(3):687-696.

［6］Hayman D S.Endogone spore numbers in soil and vesicular-arbuscular mycorrhiza in wheat as influenced by season ans soil treatment［J］.Transactions of the British Mycological Society，1970，54(1):53-63.

［7］劉潤進，李曉林.叢枝菌根及其應用［M］.北京:科學出版社，2000:1-224.

［8］彭運生，劉恩.關于提取葉綠素方法的比較研究［J］.北京農業(yè)大學學報，1992，18(3):247-250.

［9］Govindarajulu M，Pfeffer P E，Jin Hairu，et al.Nitrogen transfer in the arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］.Nature，2005，435:819-823.

［10］Tawaraya K，Saito M，Morioka M，et al.Effect of phosphate application to arbuscular mycorrhizal onion［Allium cepa］on the development and succinate dehydrogenase activity of internal hyphae［J］.Soil Science and Plant Nutrition，1994，40(4):667-673.

［11］郭濤，申鴻，彭思利，等.氮、磷供給水平對叢枝菌根真菌生長發(fā)育的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學報，2009，15(3):690-695.

［12］李俠，張俊伶.叢枝菌根根外菌絲對不同形態(tài)氮素的吸收能力［J］.核農學報，2007，21(2):195-200.

［13］Hawkins H J，Johansen A，George E.Uptake and transport of organic and inorganic nitrogen by arbuscular mycorrhizal fungi［J］.Plant Soil，2000，226(2):275-285.

［14］田萌萌，吉春龍，劉潔，等.葡萄糖、根浸出液對叢枝菌根真菌吸收不同外源氮產生精氨酸的影響［J］.微生物學通報，2011，38(1):14-20.

［15］鄧胤，申鴻，郭濤.叢枝菌根利用氮素研究進展［J］.生態(tài)學報，2009，29(10):5627-5635.