一株拮抗紋枯病菌放線菌的篩選及鑒定

崔宇輝，王媛媛，汪鵬榮，高愛同，曹麗凌，蔣冬花

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

水稻紋枯病俗稱“花腳病”，為水稻三大病害之一，尤以密植矮稈雜交稻的高產田發病最為普遍和嚴重，往往導致水稻葉片枯死、結實率降低、千粒質量減輕，一般發病田塊能導致減產15% ～20%，嚴重時可達60% ～70%，甚至絕收［1-2］.該病在早、中、晚稻上均有發生，危害性極大，在世界各稻作區普遍發生，且近年來有逐年加重的趨勢［3］.

水稻紋枯病是由立枯絲核菌侵染引起的一種真菌病害，又稱云紋病，其典型癥狀是云紋狀病斑和菌核［4］.2010年，于艷敏等［5］篩選到一株芽孢桿菌屬的生防菌R13對水稻紋枯病病原菌具有一定的抑制作用，抑菌率為67.8%，可以導致正常的紋枯病菌絲體發生扭曲、變形、原生質外溢，并且明顯延遲了菌核的形成時間.2011年，農倩等［6］從水稻體內分離得到的細菌菌株B196對水稻紋枯病菌的生長有較強的抑制作用.在缺乏水稻抗紋枯病品種的情況下，生產中用的藥劑有:井岡霉素、滅銹胺、苯甲丙環唑乳油等［7-8］.其中，最常用的井岡霉素自1973年由上海農藥研究所開發應用以來，一直是抗紋枯病的當家藥品，但因長期連續使用，造成病菌抗藥性增強，從而使防治效果不理想［9］.所以，有必要探索利用拮抗微生物進行生物防治的新途徑，篩選出更多的有應用價值的拮抗紋枯病的新菌種.

本研究對采自金華市各地的68份土壤中的放線菌株進行分離篩選，獲得一株對紋枯病菌具有較強拮抗作用的放線菌Sh-43菌株，通過形態特征、培養特征、生理生化特征和16S rDNA序列及系統發育分析等方面的研究，鑒定Sh-43菌株為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)由浙江省農業科學院提供;苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)由浙江師范大學化學與生命科學學院微生物實驗室保存.

1.2 培養基

放線菌的分離和保存采用高氏一號培養基;拮抗放線菌株的篩選及苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌和番茄葉霉病菌的培養均采用PDA培養基.

高氏一號培養基:可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH 7.2 ～7.4.

1.3 土壤中放線菌的分離與純化

將土壤自然風干，在28℃下放置5～7 d，用研缽磨細.采用稀釋涂布法對土壤中的放線菌進行分離，純化后的單菌落轉接到高氏一號斜面培養基上編號培養，保存待用.

1.4 平皿對峙法篩選拮抗放線菌

將PDA培養基融化后，倒入滅菌的平板中冷卻凝固，以平板原點為中心，中央接入直徑為6 mm的放線菌菌餅，其周圍等距離處接入3個直徑為6 mm的紋枯病菌菌餅(見圖1(b))，每處理3次重復，置于28℃恒溫箱中培養，5 d后測量各篩選菌菌落邊緣和紋枯病菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度.

1.5 抑菌譜的測定

以篩選到的抑菌作用最強的菌株作為目的菌株，與苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、番茄葉霉病菌3種植物病原真菌進行對峙培養，測定抑菌譜.

1.6 菌株形態特征、生理生化特征及培養特征的測定

待鑒定的菌株進行插片培養，將所觀察到的形態結果顯微照相.培養特征及生理生化特征的測定參照文獻［10］，并記錄各項指標.

1.7 菌體DNA的提取、16S rDNA序列PCR擴增及系統發育樹的構建

圖1 Sh-43菌株的菌落形態和對紋枯病菌的抑菌效果

按照上海生工生物工程技術服務有限公司SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取樣品的基因組 DNA.通用引物7f的序列為5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，1540r的序列為5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.

聚合酶鏈式反應(PCR)擴增程序為:98℃預變性5 min，95℃變性35 s，55℃復性35 s，72℃延伸1 min 30 s，35個循環擴增;72℃延伸8 min.

PCR產物純化后經上海生工生物工程技術有限公司完成測序.將測得的基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行對比分析，并利用 MEGA4以 N-J法繪制系統發育樹.

2 結果與分析

2.1 放線菌菌株的獲得

在采集到的68份土樣中，利用稀釋涂布法，根據菌落形態、大小、色澤與生長速度等特征，分離純化得到了406株放線菌.

2.2 平皿對峙法篩選拮抗放線菌

利用平皿對峙法測定放線菌株對紋枯病菌的拮抗作用.結果表明:分離到的406株放線菌中共有42株對紋枯病菌有不同程度的抑制作用(見表1)，占分離菌株總數的10.3%，它們產生的生物活性物質可對紋枯病菌起到抑制作用，靠近活性菌株一側的紋枯菌菌絲表現生長速度減弱;Sh-43菌株的抑菌效果最好，抑菌帶寬度為28.3 mm(見圖1).

表1 42株對水稻紋枯病菌有抑制作用的放線菌株

2.3 抑菌譜的測定

供試菌株的篩選結果表明，Sh-43菌株對紋枯病菌有較強的拮抗作用.利用對峙培養法測定Sh-43菌株的抑菌譜，結果如表2所示.由此可知，Sh-43菌株對苦瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌和番茄葉霉病菌這3種植物病原真菌也具有較強的拮抗作用.

2.4 Sh-43菌株形態特征、生理生化特征及培養特征的測定

菌株形態觀察結果表明，Sh-43菌株能夠在高氏一號培養基上生長，可形成氣生菌絲，氣生菌絲成熟后發育成孢子絲，孢子絲呈波曲或螺旋狀(見圖2).

表2 Sh-43菌株抑菌譜的測定結果

生理生化實驗結果(見表3)表明:Sh-43菌株可使明膠緩慢液化，可緩慢水解淀粉，牛奶不凝固，伏譜(V-P)實驗呈陰性，可利用肌醇、麥芽糖、D-甘露醇、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等8種碳源.

圖2 Sh-43菌株的顯微特征(×400)

表3 Sh-43菌株生理生化特征的測定結果

2.5 16S rDNA序列及系統發育分析

Sh-43菌株基因組 DNA的提取結果見圖3.采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得一長度為1 388 bp的基因(見圖3)，序列測定由上海生工生物工程技術有限公司完成.

基于16S rDNA序列分析進行細菌鑒定是國際上通用的鑒定技術.一般認為:16S rDNA序列同源性小于98%，可以認為種不同;同源性小于93% ～95%，可以認為屬不同［11］.將Sh-43菌株16S rDNA基因序列通過Blast比對分析，Sh-43菌株與吸水鏈霉菌的遺傳距離最小，同源性高達100%.基于16S rDNA基因序列建立的鏈霉菌屬系統發育樹見圖4.故將Sh-43菌株鑒定為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

圖3 Sh-43菌株的電泳分析圖

3 結論與討論

本研究通過對不同地區土樣中放線菌的分離篩選，獲得了一株拮抗紋枯病菌的Sh-43菌株.通過觀察菌株的形態和培養特征，分析其生理生化特性，根據文獻［12］確定Sh-43菌株為鏈霉菌屬，再結合菌株的16S rDNA序列的聚類分析結果，最后將其鑒定為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus).

圖4 基于16S rDNA基因序列建立的鏈霉菌屬(Streptomyces)系統發育樹

國內已有不少有關應用拮抗微生物防治紋枯病的研究報道.陳宏州等［13］從水稻根圍土樣中篩選得到對水稻紋枯病菌有顯著拮抗活性的放線菌菌株，其發酵濾液在稀釋10倍時對水稻紋枯病菌的抑菌活力達46.21%.鄭愛萍等［14］從健康的水稻植株、感染紋枯病水稻植株及根際土壤、秧田水、菌核上分離出了能拮抗紋枯病的細菌，從中挑選在實驗室中作用效果明顯的菌株，對其分別進行了抑菌率、致畸性、對菌核的萌發和形成的影響度等抗生性檢測，并在液培條件下檢測了其對水稻的出苗率、葉片及根系干質量的促生性，結果表明在田間試驗中混合3種菌處理有較好的防治效果.

生理生化實驗顯示，吸水鏈霉菌Sh-43菌株對環境具有較強的適應能力;抗菌譜測定結果表明，Sh-43菌株對真菌類病原菌表現出明顯的拮抗能力.吸水鏈霉菌Sh-43菌株對紋枯病菌產生明顯的抑菌圈，表明該菌可以合成某種抗菌物質并釋放到周圍環境，其對紋枯病菌的生長和繁殖具有較強的抑制作用.因此，Sh-43菌株有希望作為生防菌用于水稻紋枯病的防治.但是，這些具有生物活性的抗菌物質的結構和功能現在尚不清楚，正在進一步的研究中.

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