凍融法提取脾臟轉移因子影響因素的試驗

劉 堯，劉宗柱

（青島農業(yè)大學生命科學學院，山東 青島 266109）

轉移因子（Transfer factor，TF）是免疫活性淋巴細胞所釋放的參與機體免疫功能的多肽與寡聚核苷酸的混合物，可以將供體的免疫特性轉移給受體的淋巴細胞，從而提高機體免疫功能。獸醫(yī)臨床常用以提高機體免疫機能以及解除免疫抑制［1-2］。TF提高機體免疫力的作用無種屬特異性，可以在不同種屬的動物之間相互轉移免疫信息。隨著我國畜禽養(yǎng)殖中免疫抑制性疾病的多發(fā)，TF相關制劑的應用愈發(fā)具有重要的臨床意義。目前，制備TF的原料較多應用的是豬、肉雞等動物的脾臟，制備工藝多采用反復凍融、高壓均質、離心、透析或超濾等工藝，但目前對轉移因子提取效率的影響因素方面的研究很少報道。本試驗以豬脾臟為試驗原料，主要研究了凍融次數(shù)、透析時間及勻漿介質對豬脾臟轉移因子中多肽及核酸含量的影響，以期為豬脾臟TF制備工藝的優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

商品豬新鮮脾臟（購自金鑼食品集團公司屠宰場）；UV-2401PC型紫外分光光度計（日本島津）；透析袋（21mm，USA進口）；絞肉機；組織勻漿機。

1.1 試驗材料及預處理 豬脾臟購自山東金鑼食品集團公司屠宰場，-20℃保存?zhèn)溆?。試驗時將豬脾臟去筋膜、脂肪，剪碎，等分為不同勻漿介質的兩組，其中一組按組織濕重1∶1的比例加入生理鹽水，另一組按組織濕重1∶1的比例加入去離子水，分別置絞肉機中攪碎，轉移到組織搗碎機中勻漿，備用。

不同勻漿介質處理后的脾臟勻漿分別裝于數(shù)支5mL聚乙烯離心管中，分別設置凍融4、6、8、10、12次；凍融結束后置于離心機中于4000r／min離心20min，取上清液4mL轉入透析袋中，置于2倍體積的緩沖液中分別透析0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h。透析結束后取透析液于4℃保存待測。

1.2 透析液中轉移因子多肽與核酸濃度測定 透析液中多肽含量用Lowery（福林酚）法測定；核酸用苔黑酚法測定；每個取樣點設置3個平行樣，各點的數(shù)值為平行樣的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 透析不同時間點多肽及核酸的濃度數(shù)值以平均值 標準差表示，SPSS軟件檢驗其差異的顯著性。

2 結果

2.1 勻漿介質及凍融次數(shù)對轉移因子提取效率的影響 通過預備試驗，初步確定了透析時間為24h時透析液中多肽及核酸基本達到透析平衡。對不同勻漿介質和凍融次數(shù)處理后，測定上清液透析24h時透析液中多肽濃度、核酸濃度的變化如圖1、2所示。

反復凍融6次時，透析液中多肽的濃度最高，凍融次數(shù)超過8次，透析液中多肽濃度反而有降低的趨勢。原因可能在于凍融次數(shù)過多使細胞內溶酶體水解酶釋放較多，從而使多肽等活性成分降解的比例增加。不同凍融次數(shù)下以去離子水為勻漿介質的多肽收率均略高于生理鹽水，說明以去離子水為勻漿介質破碎細胞的效果較好。

透析液中核酸的變化趨勢與多肽濃度的變化基本一致（圖2）。以去離子水為勻漿介質，反復凍融4、6、8、10次和12次時，透析出的核酸濃度比生理鹽水更高，說明去離子水為勻漿介質在反復凍融過程中對細胞膜的破壞更有助于核酸的釋放。

2.2 透析時間對轉移因子提取率的影響 通過對凍融次數(shù)和勻漿液的試驗為基礎，我們選定用去離子水勻漿，勻漿液凍融6次，對多肽以及核酸透析達到平衡的時間進行研究。結果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著透析時間的增加，轉移因子中多肽的含量不斷增加，在透析24h的時候基本趨向平穩(wěn)，雖然在48h的時候達到了高峰，但與透析24h相比，其升高的幅度并不大，因而從生產(chǎn)效率的角度考慮，對于多肽的收率，透析24h就已足夠。

在12h前，核酸的含量隨著透析時間的增加穩(wěn)步快速上升，12h以后上升的速度開始下降，直到24h時達到峰值，此后核酸的含量開始下降。

3 討論

轉移因子因其獨特的作用特點在獸醫(yī)臨床的應用越來越廣泛，但對于轉移因子制備技術方面的研究報道尚不多見。鄧夕軍等研究了在勻漿液中加入檸檬酸鈉作為凝絮劑，可以加快反復凍融后離心分離上清液的速度，并比較了超濾法和透析法的分離效率，但對于反復凍融次數(shù)、勻漿介質以及透析的合適時間等因素沒有涉及［3］。

利用豬脾臟提取轉移因子的關鍵步驟是破碎細胞，使細胞內的多肽及核酸充分釋放出來。反復凍融法破碎細胞的基本原理在于，當組織勻漿處于冰點時，細胞內外的水分形成冰晶結構，冰晶體積的膨脹導致細胞的膜結構被破壞。伴隨著這一過程，細胞局部的脫水、pH值的變化等，也會導致細胞膜結構的變化。不同的勻漿介質會影響冰晶形成的過程以及細胞內外的滲透壓梯度的大小，從而影響凍融時細胞的破碎效果。目前所報道的轉移因子制備方法中，勻漿介質有的采用去離子水，有的采用生理鹽水，但采用不同的勻漿介質對轉移因子提取效率的影響未見報道。本試驗結果表明，用去離子水的效果要明顯好于用生理鹽水，這是因為用去離子水時脾臟細胞的內外滲透壓要大于用生理鹽水時的滲透壓，更容易使細胞破碎，讓細胞內容物更容易釋放出來。

反復凍融結合高壓均質或超聲破碎細胞，仍是目前轉移因子規(guī)模化生產(chǎn)的常規(guī)方法。生產(chǎn)過程中的反復冷凍是一個相對耗能、耗時的環(huán)節(jié)，也是影響轉移因子生產(chǎn)成本的重要因素。目前報道的方法中反復凍融的次數(shù)在3～10次不等［4-5］，我們的試驗結果表明，反復凍融6次以上，多肽及核酸的透析濃度并沒有顯著增加。說明脾臟細胞經(jīng)過6次反復凍融已基本破碎完全，根據(jù)生產(chǎn)實際選擇凍融次數(shù)4～6次是比較合適的，太多的反復凍融沒有什么意義，反而增加生產(chǎn)成本。

多肽的透析到24h的時候趨向穩(wěn)定，雖然此后還緩慢增長，但是增長并不顯著，而核酸在12h以前含量急速上升，在12h到24h比較平穩(wěn)且緩慢地上升，這是由透析的原理決定的，即當透析內外液濃度達到動態(tài)平衡時透析就宣告結束，繼續(xù)透析已無實際價值。提高透析效率的簡單有效措施是多次透析，因此在條件允許的情況下，實施多段分次透析，透析外液使用去離子水，提高濃度差，從而提高轉移因子的收率。另外，采用中空纖維超濾法制備轉移因子，具有提取效率高、生產(chǎn)功效高的特點［4］，是值得推廣的規(guī)模化生產(chǎn)方法。

［1］李猶平，房春林，陳元坤，等.轉移因子對豬瘟和豬藍耳病疫苗免疫增強效果試驗［J］.獸醫(yī)導刊，2010，2：47-48.

［2］李鑫.轉移因子的研究進展［J］.畜禽業(yè)，2010，6（254）：38-40.

［3］鄧夕軍，黃顯泰，李俊山，等.豬脾轉移因子口服液的工藝改進［J］.中國現(xiàn)代應用醫(yī)學，1998，15（3）：58-59.

［4］閆肅，楊琳，申鎮(zhèn)維，等.轉移因子口服液制備方法的研究［J］.中國衛(wèi)生工程學，2007，6（6）：355-356.

［5］張 英，劉松財.犬特異性轉移因子的制備及其免疫活性檢測［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（S）：162-165.