凍融法提取脾臟轉(zhuǎn)移因子影響因素的試驗

劉 堯，劉宗柱

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer factor，TF）是免疫活性淋巴細(xì)胞所釋放的參與機(jī)體免疫功能的多肽與寡聚核苷酸的混合物，可以將供體的免疫特性轉(zhuǎn)移給受體的淋巴細(xì)胞，從而提高機(jī)體免疫功能。獸醫(yī)臨床常用以提高機(jī)體免疫機(jī)能以及解除免疫抑制［1-2］。TF提高機(jī)體免疫力的作用無種屬特異性，可以在不同種屬的動物之間相互轉(zhuǎn)移免疫信息。隨著我國畜禽養(yǎng)殖中免疫抑制性疾病的多發(fā)，TF相關(guān)制劑的應(yīng)用愈發(fā)具有重要的臨床意義。目前，制備TF的原料較多應(yīng)用的是豬、肉雞等動物的脾臟，制備工藝多采用反復(fù)凍融、高壓均質(zhì)、離心、透析或超濾等工藝，但目前對轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響因素方面的研究很少報道。本試驗以豬脾臟為試驗原料，主要研究了凍融次數(shù)、透析時間及勻漿介質(zhì)對豬脾臟轉(zhuǎn)移因子中多肽及核酸含量的影響，以期為豬脾臟TF制備工藝的優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

商品豬新鮮脾臟（購自金鑼食品集團(tuán)公司屠宰場）；UV-2401PC型紫外分光光度計（日本島津）；透析袋（21mm，USA進(jìn)口）；絞肉機(jī)；組織勻漿機(jī)。

1.1 試驗材料及預(yù)處理 豬脾臟購自山東金鑼食品集團(tuán)公司屠宰場，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灂r將豬脾臟去筋膜、脂肪，剪碎，等分為不同勻漿介質(zhì)的兩組，其中一組按組織濕重1∶1的比例加入生理鹽水，另一組按組織濕重1∶1的比例加入去離子水，分別置絞肉機(jī)中攪碎，轉(zhuǎn)移到組織搗碎機(jī)中勻漿，備用。

不同勻漿介質(zhì)處理后的脾臟勻漿分別裝于數(shù)支5mL聚乙烯離心管中，分別設(shè)置凍融4、6、8、10、12次；凍融結(jié)束后置于離心機(jī)中于4000r／min離心20min，取上清液4mL轉(zhuǎn)入透析袋中，置于2倍體積的緩沖液中分別透析0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h。透析結(jié)束后取透析液于4℃保存待測。

1.2 透析液中轉(zhuǎn)移因子多肽與核酸濃度測定 透析液中多肽含量用Lowery（福林酚）法測定；核酸用苔黑酚法測定；每個取樣點(diǎn)設(shè)置3個平行樣，各點(diǎn)的數(shù)值為平行樣的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 透析不同時間點(diǎn)多肽及核酸的濃度數(shù)值以平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS軟件檢驗其差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 勻漿介質(zhì)及凍融次數(shù)對轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響 通過預(yù)備試驗，初步確定了透析時間為24h時透析液中多肽及核酸基本達(dá)到透析平衡。對不同勻漿介質(zhì)和凍融次數(shù)處理后，測定上清液透析24h時透析液中多肽濃度、核酸濃度的變化如圖1、2所示。

反復(fù)凍融6次時，透析液中多肽的濃度最高，凍融次數(shù)超過8次，透析液中多肽濃度反而有降低的趨勢。原因可能在于凍融次數(shù)過多使細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶釋放較多，從而使多肽等活性成分降解的比例增加。不同凍融次數(shù)下以去離子水為勻漿介質(zhì)的多肽收率均略高于生理鹽水，說明以去離子水為勻漿介質(zhì)破碎細(xì)胞的效果較好。

透析液中核酸的變化趨勢與多肽濃度的變化基本一致（圖2）。以去離子水為勻漿介質(zhì)，反復(fù)凍融4、6、8、10次和12次時，透析出的核酸濃度比生理鹽水更高，說明去離子水為勻漿介質(zhì)在反復(fù)凍融過程中對細(xì)胞膜的破壞更有助于核酸的釋放。

2.2 透析時間對轉(zhuǎn)移因子提取率的影響 通過對凍融次數(shù)和勻漿液的試驗為基礎(chǔ)，我們選定用去離子水勻漿，勻漿液凍融6次，對多肽以及核酸透析達(dá)到平衡的時間進(jìn)行研究。結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著透析時間的增加，轉(zhuǎn)移因子中多肽的含量不斷增加，在透析24h的時候基本趨向平穩(wěn)，雖然在48h的時候達(dá)到了高峰，但與透析24h相比，其升高的幅度并不大，因而從生產(chǎn)效率的角度考慮，對于多肽的收率，透析24h就已足夠。

在12h前，核酸的含量隨著透析時間的增加穩(wěn)步快速上升，12h以后上升的速度開始下降，直到24h時達(dá)到峰值，此后核酸的含量開始下降。

3 討論

轉(zhuǎn)移因子因其獨(dú)特的作用特點(diǎn)在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用越來越廣泛，但對于轉(zhuǎn)移因子制備技術(shù)方面的研究報道尚不多見。鄧夕軍等研究了在勻漿液中加入檸檬酸鈉作為凝絮劑，可以加快反復(fù)凍融后離心分離上清液的速度，并比較了超濾法和透析法的分離效率，但對于反復(fù)凍融次數(shù)、勻漿介質(zhì)以及透析的合適時間等因素沒有涉及［3］。

利用豬脾臟提取轉(zhuǎn)移因子的關(guān)鍵步驟是破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的多肽及核酸充分釋放出來。反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞的基本原理在于，當(dāng)組織勻漿處于冰點(diǎn)時，細(xì)胞內(nèi)外的水分形成冰晶結(jié)構(gòu)，冰晶體積的膨脹導(dǎo)致細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)被破壞。伴隨著這一過程，細(xì)胞局部的脫水、pH值的變化等，也會導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化。不同的勻漿介質(zhì)會影響冰晶形成的過程以及細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓梯度的大小，從而影響凍融時細(xì)胞的破碎效果。目前所報道的轉(zhuǎn)移因子制備方法中，勻漿介質(zhì)有的采用去離子水，有的采用生理鹽水，但采用不同的勻漿介質(zhì)對轉(zhuǎn)移因子提取效率的影響未見報道。本試驗結(jié)果表明，用去離子水的效果要明顯好于用生理鹽水，這是因為用去離子水時脾臟細(xì)胞的內(nèi)外滲透壓要大于用生理鹽水時的滲透壓，更容易使細(xì)胞破碎，讓細(xì)胞內(nèi)容物更容易釋放出來。

反復(fù)凍融結(jié)合高壓均質(zhì)或超聲破碎細(xì)胞，仍是目前轉(zhuǎn)移因子規(guī)模化生產(chǎn)的常規(guī)方法。生產(chǎn)過程中的反復(fù)冷凍是一個相對耗能、耗時的環(huán)節(jié)，也是影響轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)成本的重要因素。目前報道的方法中反復(fù)凍融的次數(shù)在3～10次不等［4-5］，我們的試驗結(jié)果表明，反復(fù)凍融6次以上，多肽及核酸的透析濃度并沒有顯著增加。說明脾臟細(xì)胞經(jīng)過6次反復(fù)凍融已基本破碎完全，根據(jù)生產(chǎn)實際選擇凍融次數(shù)4～6次是比較合適的，太多的反復(fù)凍融沒有什么意義，反而增加生產(chǎn)成本。

多肽的透析到24h的時候趨向穩(wěn)定，雖然此后還緩慢增長，但是增長并不顯著，而核酸在12h以前含量急速上升，在12h到24h比較平穩(wěn)且緩慢地上升，這是由透析的原理決定的，即當(dāng)透析內(nèi)外液濃度達(dá)到動態(tài)平衡時透析就宣告結(jié)束，繼續(xù)透析已無實際價值。提高透析效率的簡單有效措施是多次透析，因此在條件允許的情況下，實施多段分次透析，透析外液使用去離子水，提高濃度差，從而提高轉(zhuǎn)移因子的收率。另外，采用中空纖維超濾法制備轉(zhuǎn)移因子，具有提取效率高、生產(chǎn)功效高的特點(diǎn)［4］，是值得推廣的規(guī)模化生產(chǎn)方法。

［1］李猶平，房春林，陳元坤，等.轉(zhuǎn)移因子對豬瘟和豬藍(lán)耳病疫苗免疫增強(qiáng)效果試驗［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010，2：47-48.

［2］李鑫.轉(zhuǎn)移因子的研究進(jìn)展［J］.畜禽業(yè)，2010，6（254）：38-40.

［3］鄧夕軍，黃顯泰，李俊山，等.豬脾轉(zhuǎn)移因子口服液的工藝改進(jìn)［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用醫(yī)學(xué)，1998，15（3）：58-59.

［4］閆肅，楊琳，申鎮(zhèn)維，等.轉(zhuǎn)移因子口服液制備方法的研究［J］.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2007，6（6）：355-356.

［5］張 英，劉松財.犬特異性轉(zhuǎn)移因子的制備及其免疫活性檢測［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（S）：162-165.