金剛鸚鵡多殺性巴氏桿菌的分離鑒定

賀青梅，張紅見(jiàn)，文 英

（1.青海省天峻縣動(dòng)物疫病控制中心，青海 天峻 817200；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810003）

2009年5月底，青藏高原野生動(dòng)物園送檢病死金剛鸚鵡1只。金剛鸚鵡屬大型攀禽，為國(guó)家級(jí)保護(hù)動(dòng)物。通過(guò)詢問(wèn)飼養(yǎng)員了解其臨床癥狀為：發(fā)病病程短，發(fā)病急，鼻流褐色分泌物，繼而突然倒地、抽搐而死亡。剖檢觀察病理變化：口腔、氣管內(nèi)有較多黏液，整個(gè)右側(cè)肺發(fā)黑、微腫，肝臟微腫、有點(diǎn)狀出血，心冠脂肪有散在出血點(diǎn)，其他臟器病變不明顯。筆者對(duì)病死金剛鸚鵡病料進(jìn)行了病原的分離鑒定，分離出1株多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，PM），暫命名為金剛鸚鵡株，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 無(wú)菌采取病死金剛鸚鵡心、肝、脾、肺、腎等臟器，置4℃冰箱待檢。

1.2 培養(yǎng)基 鮮血瓊脂平板、血清瓊脂平板由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防實(shí)驗(yàn)室自制；5%犢牛血清肉湯，購(gòu)自北京燕生政博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：081102；MH培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)：0081206；各種生化培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：080606。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小鼠4只（16～20g），購(gòu)于青海省地方病研究所。

1.4 藥敏紙片 購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)：090311。

1.5 病料制片染色鏡檢 將病料進(jìn)行觸片，分別革蘭、瑞特染色，鏡檢。

1.6 分離培養(yǎng) 將病料無(wú)菌接種于5%犢牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯、血清瓊脂平板、血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，爾后進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.7 生化試驗(yàn) 用滅菌接種環(huán)勾取少許純培養(yǎng)物接種于各種生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn) 將純培養(yǎng)物制成菌懸液注射小鼠4只，0.2mL／只。另取小鼠2只，腹腔注射0.1mL生理鹽水（對(duì)照）。

1.9 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的操作程序進(jìn)行。同時(shí)用大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。以NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥（R）、敏感（S）及中介（I）判定結(jié)果。用滅菌生理鹽水將純化好的培養(yǎng)物洗下，稀釋后與麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)比后，選取3×108個(gè)活菌／mL量的濃度。用滅菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布到整個(gè)MH培養(yǎng)基上，經(jīng)溫箱干燥3～5min后貼上各種藥敏紙片，每塊貼3種，37℃倒置培養(yǎng)18～24h后判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 觸片染色鏡檢 革蘭染色鏡檢見(jiàn)革蘭陰性、散在的小桿菌；瑞氏染色見(jiàn)到大量?jī)蓸O濃染的藍(lán)色小桿菌。

2.2 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性 血清肉湯培養(yǎng)24h輕度渾濁，連續(xù)培養(yǎng)4～6d，有菌膜產(chǎn)生，液體清朗，管底有黏稠液體；在鮮血瓊脂平板上形成灰白色、圓形、微隆起、半透明、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊露珠樣的小菌落，不溶血。

2.3 生化試驗(yàn) 將純培養(yǎng)物接種各種生化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48h，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金剛鸚鵡株巴氏桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，金剛鸚鵡株發(fā)酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、蕈糖產(chǎn)酸，不分解麥芽糖、木糖、衛(wèi)矛醇、山梨醇、肌醇；水楊苷陽(yáng)性；M.R.陽(yáng)性，V-P陰性；吲哚陽(yáng)性；明膠液化陽(yáng)性；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陰性；硫化氫陰性；能利用枸櫞酸鹽；硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性；無(wú)運(yùn)動(dòng)力，氧化酶陰性；尿素酶陰性。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn) 試驗(yàn)組4只小鼠在24h內(nèi)均死亡，從小鼠體內(nèi)臟器中分離到與注射菌株一致的革蘭陰性小桿菌，對(duì)照組小鼠未死亡。

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)語(yǔ)與討論

3.1 結(jié)語(yǔ) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，確定為禽多殺性巴氏桿菌。

3.2 討論 此次發(fā)病是由于青藏高原野生動(dòng)物園2009年4月喬遷新址，此時(shí)正處于冬春交替之際，珍禽應(yīng)激造成機(jī)體抵抗力下降，而巴氏桿菌為條件性致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降后，病原菌侵入機(jī)體，發(fā)生內(nèi)源性感染。因此，加強(qiáng)預(yù)防對(duì)于疾病的防控尤其重要。除發(fā)病后要迅速隔離，嚴(yán)格消毒，以防病原擴(kuò)散外，平時(shí)應(yīng)做好飼養(yǎng)管理工作，避免珍禽受寒，減少應(yīng)激，保持圈舍清潔并作好消毒工作，接種疫苗，以減少本病的發(fā)生。

從生化試驗(yàn)看，分離的PM能發(fā)酵乳糖、鼠李糖產(chǎn)酸，衛(wèi)矛醇、H2S陰性，水楊苷陽(yáng)性，這與有些報(bào)道不符。其主要原因是：PM有不同的血清型，不同血清型的生化差異很大，即使是同一血清型不同分離株的生化反應(yīng)也不盡相同。本次分離到的PM為何種血清型，尚需進(jìn)一步的鑒定。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，此巴氏桿菌對(duì)所測(cè)試的藥物敏感率為88.1%，這與青藏高原野生動(dòng)物園的珍禽未濫用抗生素，細(xì)菌未對(duì)大部分抗生素產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。菌株對(duì)所測(cè)試的喹諾酮類抗菌藥、磺胺類抗菌藥敏感；對(duì)大部分頭孢菌素類抗生素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、磷霉素和阿奇霉素等敏感；而對(duì)大部分青霉素類抗生素、紅霉素、克林霉素、利福平等耐藥。此結(jié)果可為以后的珍禽防治提供參考。

表2 金剛鸚鵡株巴氏桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果