重組人體干細胞因子的表達、復性、純化及其對臍帶血干細胞體外擴增作用研究

范 潔,丁欣欣,蔣永平,2

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院蘇州方舟生物醫(yī)藥研發(fā)中心,江蘇蘇州,215126;2.蘇州方舟基因藥業(yè)有限公司,江蘇蘇州,215126)

在需要造血干細胞的相關臨床治療中,骨髓移植作為造血干細胞(HSC)的來源之一,是目前應用比較廣泛的治療手段[1]。胎兒臍血(UCB)中含有大量的造血干細胞,另外,新生兒的造血干細胞其增殖潛力更強,生命周期及端粒更長[2]。單份UCB中HSC絕對數(shù)量較少,無法滿足臨床需求。因此要促進UCB的應用首先要解決UCB體外擴增的問題[3]。CD34蛋白多表達于造血干/祖細胞表面,CD34+細胞具有集落形成能力和強大的增殖能力。因此,需要對CD34+細胞群體加以體外擴增培養(yǎng),以獲得大量的具有分化潛能的HSC[4]。適量干細胞因子(SCF)與其他細胞因子聯(lián)用可對HSC進行有效的體外擴增[5]。目前國內SCF原核表達多采用熱誘導表達或表達分泌型蛋白,具有一系列缺陷,本實驗采用IPTG誘導表達獲取包涵體,可有效提高SCF表達量,同時減少因溫度不易控制而造成的表達量不理想等問題,為重組人體干細胞因子(rhSCF)的臨床研究及HSC的體外擴增應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

表達rhSCF的E.coli BL21工程菌由Genscript公司制備;新生兒臍帶血標本來自于蘇州九龍醫(yī)院及蘇州大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科,所采臍血均征得患者同意。

1.2 方法

1.2.1 rhSCF蛋白誘導表達及純化:將成功轉化了表達質粒pET43.1a-SCF的E.coli BL21接種于100 μ g/mL氨芐西林的 2×YT培養(yǎng)液,搖菌、離心沉淀、超聲裂菌、再離心、去離子水洗后獲得包涵體。將包涵體攪拌并稀釋后透析。純化復性后的rhSCF,存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 純化蛋白的凝膠分析:對rhSCF包涵體及純化后的rhSCF的SDS-PAGE圖像進行光密度掃描和圖像分析。

1.2.3 蛋白序列測定:采用Edman降解法,對純化后的樣品N端10個氨基酸進行測序,以確認所獲樣品是rhSCF。

1.2.4 從臍帶血中提取CD34+細胞:將新鮮臍帶血稀釋混勻,利用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離單核細胞。按照操作說明進行,每1×108個單核細胞加入300 μ L分選緩沖液、100 mL FcR阻斷劑、100 μ L微珠標記抗 CD34抗體,4 ℃孵育 30 min,10 mL緩沖液洗滌后離心棄上清,5 mL緩沖液重懸細胞,分離裝置獲得CD34+細胞。

1.2.5 rhSCF在臍血CD34+細胞的體外擴增中的作用:根據(jù)之前實驗結果,SCF 200 ng/mL+血小板生成素(TPO)50 ng/mL+FLT-3配體(FL)200 ng/mL為細胞擴增最佳組合,將分選所得的細胞均分為9組,每組3個孔,接種于24孔板中培養(yǎng),初始細胞數(shù)為1×104個/孔。9組分別為:PC 1組(標準品SCF 200 ng/mL+TPO 50 ng/mL+FL 200 ng/mL),NC1組(無細胞因子),SCF 0組、SCF 1組、SCF 2組、SCF 3組、SCF 4組、SCF 5組、SCF 6組均加入 TPO 50 ng/mL+FL 200 ng/mL,同時SCF 0～6組分別加入樣品 rhSCF 0、50 、100 、200 、300、400 、500 ng/mL 。于體積分數(shù)5%CO2、37℃條件下培養(yǎng) 1周,細胞計數(shù),流式細胞儀檢測CD34+細胞比例。

1.2.6 流式分析:取適量待檢測細胞,用含1%BSA PBS洗滌并計數(shù),離心棄上清,按細胞數(shù)加入適量抗人CD34-PE單抗或同型免疫球蛋白G1(IgG1),避光常溫孵育15 min后洗滌1次,加入 350 μ L PBS 重懸細胞,BeckmanCoulterTMFC 500流式檢測。

2 結 果

2.1 rhSCF誘導表達及純化

復性純化并濃縮后的rhSCF濃度為0.5 g/L。經(jīng)過離子交換柱和凝膠過濾等過程后,蛋白獲得了較好的純化,圖中無明顯肉眼可見雜蛋白條帶,見圖1。

(列1:非誘導菌;列 2:誘導菌;列3:rhSCF包涵體;列4:純化rhSCF)

2.2 rhSCF圖像的光密度掃描及凝膠分析

對圖1進行光密度掃描,同一本底條件下,rhSCF包涵體中目的蛋白純度達到79%,純化后rhSCF中目的蛋白純度達95%以上。

2.3 蛋白序列測定

經(jīng)上海基康生物技術有限公司對純化蛋白N端10個氨基酸進行測定,所獲結果與目的rhSCF序列相一致。證明所獲蛋白確為rhSCF。

2.4 rhSCF在臍血CD34+細胞的體外擴增中的作用

NC1組缺少細胞因子,CD34+細胞無法進行體外擴增,1周后鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞全部死亡;SCF0組TPO與FL聯(lián)用,CD34+細胞培養(yǎng)1周后有少量擴增;SCF 1-5組rhSCF、TPO和FL聯(lián)用,細胞增殖倍數(shù)顯著提高并呈現(xiàn)與 rhSCF劑量相關關系,當rhSCF濃度達到200 ng/mL時增殖倍數(shù)達到最高,之后細胞增殖倍數(shù)略有下降并維持在相對穩(wěn)定的水平,見圖2。同PC1組SCF標準品相比,純化獲得的rhSCF在相同濃度下細胞增殖倍數(shù)無顯著差異(置信區(qū)間為95%,P=0.305),同時所有加入了細胞因子的組均同NC1組存在著差異(P<0.05),見表1。本實驗室以標準品rhSCF作為變量檢驗不同濃度rhSCF對干細胞體外擴增的影響,見圖3。(本部分數(shù)據(jù)尚未公開發(fā)表)

圖2 CD34+細胞的體外擴增與rhSCF和標準品SCF的劑量關系

表1 rhSCF和標準品rhSCF對CD34+細胞的體外擴增效果( x±s)

圖3 以標準品rhSCF在臍帶血體外擴增倍數(shù)與rhSCF濃度的關系

3 討 論

由于HSC本身易分化的特點,在對其進行擴增的同時要抑制其分化是目前要解決的主要問題[6]。SCF原核表達多采用熱敏感啟動子,但其在誘導表達過程中溫度不易控制,同時分泌型SCF表達量偏低,由于蛋白本身可溶,純化不易,通常需通過添加特殊氨基酸標簽幫助純化,但這樣又會影響蛋白生物活性,而且產(chǎn)品不可直接用于人體。而本實驗通過包涵體途徑純化蛋白,由于包涵體不可溶,蛋白易純化,通過一套通用的離子交換層析和凝膠過濾系統(tǒng)即可完成蛋白復性純化全過程,此方法不影響蛋白生物活性,可直接獲得并應用高復性率高純度的rhSCF,同時包涵體表達量高并且穩(wěn)定,更適于進行工業(yè)化生產(chǎn)[7]。

本研究CD34+細胞體外擴增培養(yǎng)時,當未添加任何細胞因子時,細胞無法存活;而TPO 50 ng/mL、FL 200 ng/mL與一定濃度的SCF聯(lián)用時[8],這3種細胞因子聯(lián)用具有顯著促進細胞增殖的效果 。實驗中,在SCF濃度由0逐漸上升為500ng/mL時,細胞擴增倍數(shù)首先有顯著提升,并隨SCF質量濃度升高而升高,呈現(xiàn)正相關關系,在SCF濃度為200 ng/mL時細胞擴增倍數(shù)達到最大。這與之前本實驗室使用標準品SCF進行體外擴增實驗時的結果吻合。但是當SCF濃度在200 ng/mL以上進一步增加時,CD34+細胞擴增倍數(shù)不再隨蛋白濃度升高而升高,相反有輕微下降,提示CD34+細胞擴增倍數(shù)對SCF的劑量依賴關系存在臨界點,由于細胞數(shù)量和細胞表面SCF受體數(shù)量是不變的,因此推測當?shù)鞍诐舛鹊竭_臨界點時,蛋白與細胞上相應受體結合趨于飽和。所以當?shù)鞍诐舛冗M一步增加時,蛋白介導的生物學效應并不會隨之增強,而且由于蛋白分子增加,空間位阻效應會影響蛋白與受體的結合,因此細胞擴增倍數(shù)會有一定程度的降低。同時,在相同的質量濃度下,樣品SCF與標準品組的細胞擴增倍數(shù)統(tǒng)計學上無顯著差異,說明復性純化后獲得的rhSCF具有良好的生物活性。

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