番茄種質資源親緣關系的SSR分析

丘漫宇張素平郭爽李伯壽劉玉平

（廣州市農業科學研究院，廣東廣州 510308）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）是世界范圍內廣泛栽培的蔬菜種類之一，在我國也是一種重要的蔬菜作物，因其富含多種維生素、糖類、番茄紅素和胡蘿卜素而廣受歡迎（劉仲齊等，2004）。目前市場上廣泛栽培的番茄品種大多為雜交種。在雜交種選育過程中，種質材料間的親緣關系是作為親本選擇和雜交配組的主要依據。近年來，隨著分子標記技術的成熟和發展，其在鑒定蔬菜種質材料親緣關系中的優勢越來越明顯，SSR標記以其多態性豐富、重復性好、信息量大和PCR技術方便等優勢（艾呈祥 等，2005），正被廣泛的應用于蔬菜遺傳多樣性的應用研究中。

本試驗旨在利用 SSR分子標記技術對現有的番茄高代自交系進行親緣關系分析，劃分雜種優勢群，為今后利用雜交優勢育種提供理論依據。同時對已育成的番茄品種金豐1號、年豐、益豐的親本進行遺傳距離測定，初步探討親本的分子標記遺傳差異與雜種優勢的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗共選擇了20份番茄育種材料（表1），其中 No.1、No.2、No.3、No.5、No.6、No.8和No.9是自封頂類型，其余13份材料為無限生長類型，No.18是長貨架材料。No.3和No.4是雜交一代番茄品種金豐1號的父本和母本，No.5和No.8是雜交一代番茄品種年豐的父本和母本，No.6和No.7是雜交一代番茄品種益豐的父本和母本。2011年8月12日在溫室播種，9月8日定植大棚，每份材料定植20株，待幼苗長至6～7片真葉時混株取3～4片嫩葉于離心管中，-20 ℃保存，以備提取DNA。

1.2 試驗方法

根據Suliman-Pollatschek等（2002）的方法及SGN數據庫（http://www.sgn.cornell.edu）的數據，選取25對在番茄中可能具有多態性的SSR標記，對20份番茄高代自交系育種材料（表1）進行親緣關系分析，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取及檢測 采用改良的CTAB法（Clark，1998）提取番茄葉片總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA條帶完整性，采用UV9100B型紫外可見分光光度計測定其吸光度值，檢測純度和濃度，并稀釋為20 ng·μL-1，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 PCR擴增 擴增反應在Thermo PX2 PCR儀上進行，反應體系25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、1.6 mmol·L-1MgCl21.5 μL、0.2 μmol·L-1dNTP 2 μL、0.36 μmol·L-1Primer 正反向各 1 μL、2.5 UTaq酶 0.2 μL、20 ng模板 DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR 反應過程：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物在質量分數5%變性聚丙稀酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。

1.2.3 數據分析 在擴增產物電泳圖譜中的同一遷移位置上，有擴增條帶的記為1，無擴增條帶的記為0，得到各樣品帶型分布表。采用POPGEN32軟件計算多態位點百分率P（%）、相似系數和遺傳距離（GD），并用MTSUS2.11版軟件的非加權算術平均法（UPGMA）進行系統聚類分析，構建分子進化系統樹。

表1 20份番茄材料的編號及類型

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性分析

利用25對SSR引物對20份番茄材料進行SSR分子鑒定。結果表明，有21對引物可以在番茄材料上擴增出條帶，18對引物具有多態性，引物7的SSR擴增結果如圖1所示。從21對引物的擴增結果中共統計到66條清晰可辨的條帶，其中多態性條帶為52條，多態率為78.8%，譜帶大小為100～1000 bp。最少的可擴增出1條條帶，最多的可擴增出6條條帶，平均每對引物可擴增出3.1條條帶，其中引物10擴增出的多態性譜帶最多。

圖1 引物7對20份番茄材料的SSR擴增圖譜

2.2 遺傳距離分析

遺傳距離是衡量樣品間相似性程度的度量，遺傳距離數值越大表明材料間的差異越明顯。采用UPGMA法對SSR擴增結果進行遺傳距離計算，結果表明20份番茄材料兩兩間的遺傳距離（GD）在1.4892～9.1806之間，遺傳距離大于7的育種材料有18份，其中No.1與No.15之間的遺傳距離最大，為9.1806，表明這些材料間的遺傳差異較大，親緣關系較遠，可以據此指導田間的育種實踐，減少親本選擇和雜交配組的盲目性。

No.3與No.4為金豐1號的父本和母本，遺傳距離為2.6817；No.5與No.8為年豐的父本和母本，遺傳距離為3.2052；No.6與No.7為益豐的父本和母本，遺傳距離為7.1931。在生產實際中，益豐的產量、品質、抗病性等田間表現均明顯優于金豐1號和年豐。可見，這3個番茄品種的田間表現與其親緣關系的分子檢測結果一致，即親緣關系越遠，雜種優勢越明顯。

2.3 聚類分析

圖2 20份番茄材料SSR標記的聚類分析圖

從SSR標記的遺傳聚類分析圖可以看出（圖2），以遺傳相似系數0.67為標準可將20份番茄育種材料劃分為4大類，第1類共有13份材料，包括6份自封頂類型和7份無限生長類型；第2類共有4份材料，均為無限生長類型；第3類有2份材料，1份為自封頂類型，1份為無限生長類型；第4類只有No.181份材料，為無限生長類型的長貨架材料，與其余19份番茄材料的遺傳距離介于4.5153～7.6303之間，表明長貨架材料的遺傳背景較常規番茄育種材料的遺傳差異較大，育種實踐中可以考慮引入長貨架育種材料來改善番茄育種材料的結構，突破目前遺傳基礎趨于狹窄的局限。金豐1號和年豐的父母本均聚在了第1類，表明它們之間的遺傳相似系數較大，親緣關系較近；益豐的父本和母本遺傳距離較遠，分別聚在了第1類和第3類。

3 結論與討論

雜種優勢的強弱取決于雙親性狀間的互補性，在一定范圍內，雙親的基因差異越大，親緣關系越遠，雜種優勢就越明顯。遺傳多樣性和親緣關系分析是番茄遺傳育種研究的重要內容，有利于雜種優勢群的劃分，在育種實踐中指導親本的選擇和選配。而DNA分子標記技術的發展為種質資源親緣關系的研究提供了新的手段和方法（金鳳媚 等，2004）。在番茄遺傳多樣性研究中，趙凌俠等（2002）用RAPD分子標記對番茄屬9個種的43份材料進行了遺傳多樣性分析，將43份材料分為4個類群。姚祝平等（2010）利用AFLP分子標記對44份番茄材料進行了遺傳多樣性和親緣關系分析，從64對引物組合中篩選出15對用于擴增，共獲得364條多態性條帶，將44份番茄材料分成5個復合組和1個獨立組。

本試驗選用了在育種實踐中用于配制雜交組合或將用于配制組合的 20份高代純系番茄育種材料作為供試材料，意在將田間育種實踐與實驗室理論分析相結合，有針對性的分析育種材料之間的遺傳距離，明確這些育種材料間的親緣關系，一方面為田間育種實踐提供理論依據和參考，另一方面為實驗室理論分析尋找田間實證。從這些材料中選擇遺傳距離較大的材料進行雜交組合，在一定程度上可以減少田間親本選擇和雜交配組的盲目性。

本試驗的聚類分析結果中，并沒有將生長類型相同的材料全部劃分為一類，而是在各類群間交叉出現，這可能是由于以下兩方面原因造成的：首先，由于供試材料均為高代自交系育種材料，材料之間經過了多代的雜交和回交，難免會出現遺傳背景的交叉；其次，生長類型只是其所有性狀的一個組成部分，并不能代表所有基因組的組成，同時并沒有針對生長類型進行引物的特異選擇，從而無法將不同的生長類型完全區分開，因此出現交叉現象。所以，在今后的親緣關系分析中，在引物的選擇方面，可以考慮針對特定的某幾個目標性狀，選擇針對性較強的引物進行遺傳多樣性和親緣關系分析。

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