延胡索乙素對老年大鼠紅細胞膜影響的實驗研究

馬伯艷，袁良杰，牛雯穎，肖洪彬

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

延胡索乙素(dl－tetrahydropalmatine，dl－THP)為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalisyanhusuo W.T.Wang)中主要成分。本課題組研究已表明，dl－THP對老齡大鼠紅細胞聚集性增高有很好的改善作用，同時對紅細胞變形性也有一定影響。因此，我們擬進一步從紅細胞膜成分變化角度就dl－THP改善血液流變學機制進行研究。

1 材料

1.1 動物

清潔級健康Wistar老齡大鼠40只，清潔級健康Wistar青年大鼠10只，均由黑龍江中醫藥大學提供(合格證號SCXK(黑)2008004)，室溫20～22℃，自由飲水，飼固體飼料。

1.2 藥物

羅痛定片(主要成分為延胡索乙素，四川金藥師制藥有限公司，批號091101);阿司匹林片(黑龍江百泰藥業有限公司，批號100101)。

1.3 試劑

PBS(pH=7.4，NaCl 6g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g和 Na2HPO41.56g，溶于800 ml蒸餾水，1mol/L HCl調節溶液 pH值至7.4，蒸餾水定容至1L，4℃冰箱保存);Tris－HCl(pH=7.4，0.605g Tris溶于800ml蒸餾水中，1mol/L HCl調 pH值，補至終體積1L，4℃冰箱保存);1%抗凝劑;2ml肝素鈉注射液(每瓶 2ml，12500U)加10.5ml生理鹽水而成;1mmol/mL PMSF(0.0174g PMSF用異丙醇溶解，定容于10ml，現用現配);20%烏拉坦(20g氨基甲酸乙酯用生理鹽水溶解，定容至100ml即可，密封常溫保存)。

總膽固醇試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);唾液酸試劑盒、巰基試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 儀器

KQ－800KDE型高功率數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);722分光光度計(山東高密分析儀器廠);BECKMAN超速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司);TGL－16G型高速臺式離心機(上海醫用分析儀器廠);分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司);Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);ELSD 2000型蒸發光散射檢測器(美國Alltech公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

25～36月齡Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量(320±46)g，按體重隨機分為延胡索乙素高(延高)、低劑量組(延低)、老齡空白組(老齡空白)、阿司匹林組，每組10只;另取3～4月齡Wistar青年大鼠10只，雌雄各半，體質量(108±19)g，作為青年空白組(青齡空白)。延胡索乙素高劑量組按132.8mg/kg濃度灌胃給藥、低劑量組按33.2mg/kg濃度灌胃給藥，阿司匹林組按13.83mg/kg濃度灌胃給藥，各組按10ml/kg體積灌胃，每日1次，連續給藥14天。

2.2 取血及紅細胞膜制備

取血前禁食24h，不禁水，末次給藥1h后，大鼠腹腔注射20%烏拉坦5ml/kg麻醉，分離右側頸總動脈，采血測定各項指標及制備紅細胞膜。

取新鮮肝素抗凝血 5ml，以 3 000r/min離心10min，棄上清，除去中間層(主要為白細胞和血小板)，以1∶3比例加入等滲pH 7.4 PBS，3 000r/min離心10min，棄上清，反復洗滌3次，得到紅細胞懸液。向紅細胞懸液中以1∶80比例加入預冷5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，同時加入苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L，以80Hz 20℃超聲15min，放入4℃溶血過夜，將所得紅細胞溶血液以15 000r/min離心10min，棄上清，再加入 5mmol/L pH 7.4 Tris－HCl溶液，以15 000r/min離心10min，反復洗滌3次至乳白色膜，將其1∶1懸浮在PBS溶液中。

2.3 Na+－K+－ATP酶活性及膽固醇含量測定

Na+－K+－ATP酶活性采用比色法，按照試劑盒操作測定。紅細胞膜膽固醇含量測定采用高效液相色譜法。

2.4 唾液酸含量及巰基含量測定 唾液酸含量測定采用5－甲基苯二酚絡合法檢測;巰基含量測定采用比色法，按照試劑盒說明書規定操作。

2.5 紅細胞膜SOD活力及MDA含量測定 SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法檢測;MDA含量測定采用TBA(硫代巴比妥酸)法。按照試劑盒說明書進行。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 紅細胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響 結果見表1。

表1 延胡索乙素對紅細胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響(s，n=10)

表1 延胡索乙素對紅細胞膜膽固醇含量及Na+－K+－ATP酶活性的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)Na+－K+－ATP酶(μmolPi/mgprot/hour)膽固醇含量(mmol/mg膜蛋白)老齡空白 － 1.402 ±0.134 1.098 ±0.231青齡空白 － 2.076±0.222＊＊ 0.913±0.087*延高 132.8 1.653 ±0.127* 0.846 ±0.142＊＊延低 33.2 1.629 ±0.323 0.800 ±0.283＊＊阿司匹林13.83 1.505 ±0.350 1.053 ±0.187

由表1可見，延胡索乙素高劑量組可增加老年大鼠紅細胞膜Na+－K+－ATP酶活性(P＜0.05)，延胡索乙素兩個劑量組均可明顯降低老齡大鼠紅細胞膜膽固醇含量(P＜0.01)。

3.2 老齡鼠紅細胞膜唾液酸及巰基含量的影響 結果見表2。由表2可見，與老齡空白對照組比較，延胡索乙素高劑量組能夠明顯增加老齡大鼠紅細胞膜巰基含量(P＜0.05)，唾液酸含量有升高趨勢，但與老齡空白組比較無統計學意義。

表2 延胡索乙素對老齡鼠紅細胞膜唾液酸及巰基含量的影響(s，n=10)

表2 延胡索乙素對老齡鼠紅細胞膜唾液酸及巰基含量的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)唾液酸(mmol/gprot)巰基(mmol/gprot)老齡空白 － 0.446 ±0.110 0.264 ±0.033青齡空白 － 0.538±0.075＊＊ 0.355±0.030＊＊延高 132.8 0.495 ±0.110 0.327 ±0.033＊＊延低 33.2 0.483 ±0.084 0.276 ±0.074阿司匹林13.83 0.470 ±0.105 0.292 ±0.449

3.3 老齡大鼠紅細胞膜SOD及MDA的影響 結果見表3。

表3 延胡索乙素對老齡大鼠紅細胞膜SOD及MDA的影響(s，n=10)

表3 延胡索乙素對老齡大鼠紅細胞膜SOD及MDA的影響(s，n=10)

注:與老齡空白組比較，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01。

組別 劑量(mg/kg)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)老齡空白3.68 ±0.55 4.48 ±0.61青齡空白 － 6.09±0.34＊＊ 3.58±0.43＊＊延高 132.8 4.54 ±0.99* 3.8 ±0.4*延低 33.2 4.21 ±1.11 4.15 ±0.31阿司匹林 13.83 4.44 ±0.71 3.80 ±0.57－＊＊

由表3可見，與老齡空白對照組比較，延胡索乙素高劑量組可提高SOD活力(P＜0.05)，降低MDA水平(P＜0.05)。

4 討論

臨床上或動物實驗時測量全血黏度常采用低切變率和高切變率進行測定，而低切變率的全血粘度主要反映紅細胞的聚集程度，高切變率的全血粘度主要反映紅細胞的變形性。我們前期研究顯示，延胡索乙素高劑量組可明顯降低老年大鼠低切變率下全血黏度，對高切變率全血黏度有降低趨勢，同時可提高紅細胞變形能力趨勢。紅細胞具有變形性和聚集性與紅細胞膜的流變學特征，即紅細胞膜結構、膜的組成成分、膜的流動性等方面密切相關。膽固醇是紅細胞膜脂質主要成分，其功能是提高細胞膜雙分子層機械穩定性、調節膜流動性及通透性、維持細胞正常代謝及形態相對穩定。紅細胞自身不能合成膽固醇等脂質，而是與血漿膽固醇快速實行交換，因此當由于年齡增長而使血漿膽固醇含量升高，紅細胞膜膽固醇濃度也升高，繼而引起膜膽固醇及膽固醇/磷脂比值升高，蛋白質跨膜運動及磷脂側向運動均受到限制，膜的剛性和脆性增高，膜變形能力下降。ATP酶廣泛存在細胞質膜上，維持胞內外滲透壓平衡和跨膜電化學梯度，確保胞內外離子濃度相對穩定。本實驗研究結果顯示，老年大鼠與青年大鼠比較，其紅細胞膜膽固醇增加、Na+－K+－ATP酶活性降低、唾液酸含量及巰基含量明顯減少、MDA增加而SOD減少，說明老年大鼠上述紅細胞膜微觀指標變化是其宏觀血液流變學變化的部分原因。而延胡索乙素(尤其是延胡索乙素高劑量組)可以增強老年大鼠紅細胞膜Na+－K+－ATP酶活性、減少紅細胞膜膽固醇含量和巰基含量、減少MDA并增加SOD活性。說明延胡索乙素改善老年大鼠血液流變學異常的機制可能與上述指標變化相關。