中藥生半夏水煎液的毒性研究

嚴曉鶯，陳巨鵬，董菊，徐德國，趙鳳鳴，王明艷

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046，2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

《中國藥典》記載半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖;辛、溫;有毒;需炮制后使用。很多醫(yī)者認為［1］生半夏治療惡性腫瘤臨床效果較好，而且經(jīng)過水煎，毒性降低，服用時較為安全。南京中醫(yī)藥大學張民慶教授應用含有生半夏的滌痰化瘀方治療食道癌取得較好療效，且得到體內(nèi)和體外實驗［2－3］的證實。然而，生半夏在發(fā)揮治療作用的同時，對機體有無損傷，頗存爭議。本實驗利用骨髓微核技術和精子畸形技術對生半夏水煎液遺傳毒性進行評價，病理組織切片、HE染色對生半夏水煎液肝腎毒性進行評價，探討生半夏水煎液的遺傳毒性與肝腎毒性。

1 實驗材料

1.1 動物

ICR小鼠共25只，體質(zhì)量18～22g，購自上海斯萊克公司，合格證編號:2007000510241;飼養(yǎng)觀察3天后用于試驗。試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～25℃。自由采食、飲水，熟悉環(huán)境5日。

1.2 藥物

生半夏由南京中醫(yī)藥大學藥學院提供。注射用環(huán)磷酰胺(CP，江蘇省恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號10051921)。

1.3 試劑

小牛血清;乙醇(分析純);甲醇(分析純);吉姆薩(Giemsa)染料;2%伊紅染液;氯化鈉注射液;蒸餾水。

1.4 儀器與器材

離心機(LXJ－64－01型離心機，北京);顯微鏡(Olympus光學顯微鏡，日本);旋轉蒸發(fā)儀;吸管;1mL注射器;灌胃針;眼科剪;小平皿;濾紙;玻片;鑷子;血管鉗;漏斗。

2 實驗方法

2.1 生半夏水煎液的制備

取100g生半夏，加蒸餾水200mL浸泡30min后煎煮，水沸后小火煎煮30min，濾出藥液;再加蒸餾水100mL煎煮30min，合并兩次濾液，濃縮為50mL，終濃度為2g/mL生藥。4℃冰箱保存待用，實驗前以生理鹽水將藥液稀釋成所需的濃度。

2.2 實驗分組

將25只小鼠隨機分為5組，即陰性對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各5只。陰性對照組小鼠給予氯化鈉注射液0.25mL/20g/d灌胃給藥，連續(xù)10天;陽性對照組小鼠給予環(huán)磷酰胺40mg/kg處死前24h腹腔注射;低、中、高3個劑量組小鼠分別予1g/kg、5g/kg、25g/kg(根據(jù)成人臨床常用劑量換算，取其用量的4倍、20倍、100倍)的藥液灌胃，每24h 1次，連續(xù)10日。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

給藥后第11天，頸椎脫臼法處死小鼠，剪取一側股骨，除去血污肌肉，剪掉股骨頭，用止血鉗擠出骨髓液，與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，待自然干燥后，以甲醇固定5～10min，再以Giemsa染液染色15min，蒸餾水沖洗、晾干。

鏡檢:油鏡下按一定順序進行嗜多染紅細胞(PCE)微核計數(shù)。每只動物計數(shù)1 000個PCE，觀察含有微核PCE數(shù)，以千分率表示微核率。

2.4 小鼠精子畸形試驗

分離小鼠雙側附睪，放入盛有2mL生理鹽水注射液的小試管中，縱向剪開附睪1～2刀，輕輕搖動3～5min，雙層濾紙過濾，吸取濾液涂片，空氣晾干。甲醇固定5～10min，2%伊紅染色1h，蒸餾水沖洗，晾干。

鏡檢:高倍鏡按順序檢查精子形態(tài)，每只動物檢查完整精子1 000個。并計數(shù)無鉤、香蕉頭、無定形、胖頭、雙頭、雙尾及尾折疊的畸形精子數(shù)，計算每組動物精子畸形百分率。

2.5 病理組織形態(tài)學檢測

取小鼠的肝臟、腎臟，計算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)和腎臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量);肝臟、腎臟4%甲醛固定后，送江蘇省中醫(yī)院病理科檢測。

2.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0進行單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果

生半夏水煎液低、中劑量組誘發(fā)的微核頻率與陰性對照組相比，均無顯著性差異(P＞0.05);高劑量組誘發(fā)的微核與陰性對照組相比，有顯著差異(P＜0.05)，結果見表1，表明生半夏水煎液以25g/kg的劑量連續(xù)灌胃10天，能引起骨髓嗜多染紅細胞微核率的升高。

表1 生半夏水煎液對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率影響(s)

表1 生半夏水煎液對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率影響(s)

注:與陰性組比較，*P ＜0.05。

組別 給藥劑量 觀察PCE數(shù) 微核總數(shù) 微核率(‰)陰性組(NS)0.25mL/只/d 5 000 3 0.6 ±0.89陽性組(CP)40mg/kg/d 5 000 91 18.2 ±3.42*生半夏低劑量組 1g/kg/d 5 000 6 1.2 ±1.30生半夏中劑量組 5g/kg/d 5 000 8 1.6 ±0.89生半夏高劑量組 25g/kg/d 5 000 16 3.2 ±1.64*

3.2 小鼠精子畸形實驗結果

生半夏水煎液在各劑量組誘發(fā)的精子畸形率與陰性對照組相比，無顯著性差異(P≥0.05)，見表2。

表2 生半夏水煎液對小鼠精子畸形率影響(s)

表2 生半夏水煎液對小鼠精子畸形率影響(s)

組別 給藥劑量 觀察精子數(shù)畸形精子總數(shù)精子畸形率(‰)陰性組(NS)0.25ml/只/d 5 000 144 28.8 ±4.387生半夏高劑量組 25g/kg/d 5 000 131 26.2 ±2.387生半夏中劑量組 5g/kg/d 5 000 135 27.0 ±2.739生半夏低劑量組1g/kg/d 5 000 136 27.2 ±3.033

3.3 小鼠體質(zhì)量與肝、腎指數(shù)變化

各實驗組在飼養(yǎng)期間體質(zhì)量均有增加，生半夏水煎液低、中、高劑量組體質(zhì)量較陰性組輕，并呈劑量依賴關系，但是P≥0.05，差異無統(tǒng)計學意義。各劑量組的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)與陰性組比較，P≥0.05，差異無統(tǒng)計學差異。實驗結果表明，生半夏水煎液灌胃10天，對小鼠的體質(zhì)量、肝腎指數(shù)沒有影響，見表3。

表3 生半夏水煎液對小鼠體質(zhì)量和肝腎指數(shù)的影響(s)

表3 生半夏水煎液對小鼠體質(zhì)量和肝腎指數(shù)的影響(s)

分組 10天后體質(zhì)量 肝臟指數(shù)(×10－3)腎臟指數(shù)(×10－3)陰性組38.18 ±3.226 65.0 ±6.595 16.2 ±1.483生半夏低劑量組 38.14 ±1.865 61.4 ±5.237 17.4 ±0.894生半夏中劑量組 35.96 ±3.091 65.0 ±9.670 16.6 ±2.074生半夏高劑量組35.02 ±1.730 60.8 ±3.701 15.8 ±2.588

3.4 肝臟的HE染色

光鏡下觀察(見圖1):陰性組小鼠肝臟結構完整，肝細胞無水腫、壞死;間質(zhì)無炎細胞浸潤及纖維組織增生，未見血管及血竇擴張;生半夏水煎液低劑量組肝細胞無明顯改變;中劑量組肝細胞輕度水腫，肝血竇擴張充血;高劑量組肝細胞水腫，脂肪變性。說明高劑量的生半夏水煎液灌胃10天，對小鼠的肝臟細胞有損傷作用。

3.5 腎臟的HE染色

光鏡下觀察(見圖2):陰性組小鼠腎臟組織結構完整，腎小管無水腫，未見管型，間質(zhì)未見炎細胞浸潤;中劑量組小鼠腎小管局部輕度水腫;高劑量組小鼠腎臟實質(zhì)內(nèi)散在灶性淋巴細胞浸潤，腎小管內(nèi)可見管型形成(見圖2)。提示高劑量的生半夏水煎液對小鼠腎臟有損傷作用，腎臟是生半夏毒性作用的靶器官之一。

圖2 小鼠腎臟HE染色

4 討論

骨髓多染紅細胞的微核試驗是目前最常用的哺乳動物體內(nèi)遺傳毒學短期試驗，用于評價體細胞的染色體受損情況，當遺傳毒物作用有絲分裂期細胞，染色體發(fā)生斷裂，喪失著絲點，在細胞的有絲分裂后期，染色體應有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核，而這些受損的染色體斷片仍然滯留在細胞質(zhì)中，形成微核。本實驗低劑量和中劑量的生半夏水煎液未能引起骨髓嗜多染紅細胞微核率的升高，而高劑量的生半夏可以引起骨髓嗜多染紅細胞微核率的升高，說明在正常劑量下和療程內(nèi)生半夏對小鼠骨髓細胞沒有遺傳毒性，而在大劑量下可能對骨髓細胞有潛在的損傷，值得注意。

精子由生殖細胞產(chǎn)生，精子形態(tài)的正常與否受基因控制，當遺傳毒物引起精子畸形，則提示有相關的基因及蛋白產(chǎn)物的改變［4］，故精子畸形試驗可以反映藥物對生殖細胞基因的影響。本實驗中三組劑量的生半夏水煎液均未引起小鼠精子畸形，考慮對小鼠生殖細胞有遺傳毒性的可能性不大。

肝臟和腎臟是藥物代謝和排泄的器官，也是對藥物進行安全性評價的重要觀察對象，在對小鼠肝臟和腎臟的組織形態(tài)學的觀察結果顯示，低劑量組生半夏水煎液對小鼠的肝臟和腎臟沒有明顯影響;中劑量組對小鼠的肝臟和腎臟影響較小;高劑量組對小鼠的肝臟和腎臟有一定的毒性。

綜合上述結果，初步提示大劑量的生半夏水煎液對體細胞可能有一定毒性。進一步研究半夏復方的增效解毒打下基礎，并為生半夏的臨床合理應用提供參考。

［1］張成銘.大劑量生半夏治療惡性腫瘤16例［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9(6):108 －109.

［2］張民慶，陳華圣，許愛華，等.滌痰祛瘀湯對小鼠腫瘤的抑制作用及其機制探討［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2001，17(4):221 －222.

［3］王明艷，許冬青，劉華東，等.滌痰化瘀湯對人食管癌Eca－109細胞ras p21 p53基因表達影響的研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2009，27(3):530－531.

［4］袁伯俊，廖明陽，李波.藥物毒理學實驗方法與技術［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2007:294－295.