蘇木治療大鼠膜性腎病的實驗研究

胡克杰，趙學謙，宋成收，3

(1.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150086;2.哈爾濱醫科大學，黑龍江 哈爾濱 150086;3.齊齊哈爾市第一人民醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)常表現為腎病綜合征，病變的主要特征是腎小球基底膜增厚，腎小球毛細血管壁的上皮細胞下有沉積物，多數學者認為是一種原位免疫復合物形成致病。國內10 594例腎活檢病理資料分析顯示，原發性腎小球疾病中MN占第3位(9.54%)，且近10年來明顯增多。蘇木是我國傳統中藥材，主要含有黃酮類化合物和甾醇類化合物等，研究證實，其免疫抑制作用略強于雷公藤多甙，與環孢霉素A的對照研究表明其有抗免疫排斥作用，而無明顯的毒副作用。本實驗以MN大鼠模型為研究對象，觀察蘇木對其生化指標、病理組織及細胞因子的影響，并與雷公藤多甙等做比較，研究蘇木對MN的干預作用及其可能機制，為其臨床應用提供可靠的實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠50只，體質量150～200g之間(購自哈爾濱醫科大學附屬二院動物實驗中心)，于實驗前適應性馴養1周，實驗期間自由攝食、飲水。

1.2 實驗藥物及主要試劑 蘇木為水提取物(預制成的顆粒沖劑，批準文號0610081，三九醫藥公司);雷公藤多甙片(黃石飛云制藥有限公司);強的松(河南天方藥業股份有限公司);天然牛血清白蛋白(NBSA，河北博海生物工程有限公司);大鼠白介素18定量酶檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.3 實驗動物分組及模型復制 隨機挑選大鼠10只作為正常對照組(A組)，其余40只用于復制模型。模型組大鼠使用C－BSA 1mg，加入0.5ml PBS中，與等量的弗氏不完全佐劑混勻成乳白色懸液，在雙側腋下、腹股溝作多點皮下注射。預免疫1周后，每只大鼠尾靜脈注射 C－BSA 2.5mg(溶于1ml pH 7.4 PBS中)，每周3次，共3周。成功造模后，隨機分為4組:模型組(B組)，蘇木組(C組)，雷公藤多甙組(D組)，強的松組(E組)。

1.4 給藥方法 A、B組:每只大鼠每日給予生理鹽水1ml灌胃;C、D、E組每只大鼠每日分別給予蘇木0.5g、雷公藤多甙片1mg、強的松1ml等容灌胃，均給藥4周。

1.5 檢測指標 觀察各組大鼠精神狀態、活動情況等一般情況變化，24h尿蛋白排泄量的變化，血清BUN、Cr、TG、TC、ALB 等生化指標的變化。

1.6 大鼠IL－18定量酶檢測 采用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)。

1.7 腎臟病理檢測 腎臟組織用4%多聚甲醛中固定過夜;流水沖洗標本6h后，酒精梯度脫水;置60℃蠟箱浸蠟4h，包埋蠟塊;30%明膠涂片，涼干;切片，烤片;脫蠟至水;蘇木素及伊紅染色;染色后脫水，透明;中性樹膠封片;鏡下觀察腎臟病理改變。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 造模后約1周均出現精神不振，反應遲鈍，活動量少，攝食減少，尿量減少等現象。第4至6周，模型對照組出現皮下、陰囊水腫及腹水。第7、8周，C、D、E組大鼠狀態較前略好轉，攝食逐漸增加，體重增長，腹水、陰囊水腫明顯消退。

2.2 生化指標改變 血清BUN、Cr水平5組間無明顯差異。模型組TG、TC較正常組均明顯上升(P＜0.05)，ALB水平較正常組明顯下降(P＜0.05)。各治療組治療后TG水平與正常組相比均有升高，經藥物治療后下降，但與模型組相比差異無顯著性。各治療組治療后的TC水平明顯低于模型組(P＜0.01)，基本恢復正常。治療組的低蛋白血癥在治療后有顯著改善(P＜0.01)。各治療組間各項指標的差異均無統計學意義。結果見表1。

表1 各組大鼠生化指標的變化(s，n=10)

表1 各組大鼠生化指標的變化(s，n=10)

注:與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.01。

組別指標 正常組 模型組 蘇木組 雷公藤組 強的松組BUN(mmol/L)7.01 ±0.87 7.27 ±0.86 7.22 ±0.90 7.53 ±0.67 7.28 ±0.84 Cr(umol/L)71.54 ±6.85 77.58 ±7.45 75.42 ±5.63 76.20 ±5.52 75.26 ±5.71 TG(mmol/L)1.14 ±0.12 1.82 ±0.24△ 1.48 ±0.50 1.54 ±0.45 1.68 ±0.38 TC(mmol/L)2.12 ±0.43 3.89 ±0.45△ 2.42 ±0.53* 2.40 ±0.29* 2.51 ±0.35*ALB(mmol/L)40.60 ±3.42 25.76 ±2.54△ 30.36 ±2.87* 31.22 ±1.74* 30.98 ±2.69*

2.3 24h尿蛋白排泄量變化 實驗第8周末與第4周末比較，模型組尿蛋白定量稍有回落，但差異無顯著性;各治療組尿蛋白定量與治療前比較有明顯降低(P＜0.01);第8周末各治療組與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，即治療組尿蛋白水平顯著低于模型組，各治療組間兩兩比較差異無統計學意義。結果見表2。

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的檢測結果(s)

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的檢測結果(s)

注:與治療前(4周末)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n 4周末 8周末正常組10 6.10 ±1.54 6.60 ±1.78模型組 10 182.20 ±5.26 183.40 ±10.35蘇木組 10 182.40 ±4.92 120.20 ±5.76＊△雷公藤組 10 181.25 ±4.50 118.30 ±4.45＊△強的松組 10 182.55 ±5.30 122.00 ±4.20＊△

2.4 各組大鼠IL－18水平變化 模型組及治療組血IL－18水平均顯著高于正常組(P＜0.01)，各治療組血IL－18與模型組比較均降低(P＜0.05)，但各治療組間相比無明顯差異。結果見表3。

表3 大鼠白介素18定量酶檢測結果(s)

表3 大鼠白介素18定量酶檢測結果(s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n IL－18(ng/L)正常組10 52.64 ±3.26模型組 10 145.18 ±2.07＊＊蘇木組 10 98.02 ±2.82＊△雷公藤組 10 97.93 ±2.54＊△強的松組 10 100.57 ±3.09＊△

2.5 腎臟組織學改變 模型組腎小球體積明顯增大，球內細胞增多，毛細血管壁明顯增厚，管內出現較多紅細胞，腎小球周圍大量炎性細胞浸潤，分葉明顯，基底膜彌漫性增厚，系膜細胞增生，腎小管近曲小管水腫。治療組腎小球體積改變不明顯，球內細胞數不同程度減少，以激素組明顯，浸潤的炎性細胞也相應減少。蘇木組和雷公藤組表現相似，毛細血管內紅細胞數明顯減少，腎小球周圍僅有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織學改變

3 討論

據國內腎活檢病理結果報告，MN占成人原發性腎小球腎炎的8.8% ～11.9%，居第3位［1］，是導致慢性腎衰竭的主要原因之一。目前普遍認為，MN的發病機制為上皮下免疫復合物沉積所導致的基底膜增厚和足細胞損害，基底膜的損害正是局部形成的原位免疫復合物沉積的結果［2－3］。本研究采用C－BSA免疫大鼠的方法成功復制MN模型，其發病機制、病變穩定而典型，病理變化較一致。

幾乎所有腎臟固有細胞，包括系膜細胞、上皮細胞、內皮細胞等都有產生細胞因子的能力，并且同時又是細胞因子生物學活性的靶細胞［5］。IL－18是近年來發現的具有多種免疫調節功能的細胞因子，主要由活化的巨噬細胞產生，有許多生物學活性:刺激T細胞增殖;誘導T細胞和自然殺傷NK細胞產生IFN－γ;使T細胞分泌IL－2、GM －CSF和TNF－α;誘導T細胞和NK細胞表達Fas配體等。IL－18在MN中的作用機制主要可能為:增強Thl免疫應答的調節作用［5］;促進血管通透因子(VPF)表達［6］;導致在功能上Thl/Th2的比例失調等［5］。

近年來藥理及臨床研究證實，蘇木在免疫的細胞和分子水平均有抑制作用［7－8］，另外尚有抗炎、改善微循環［9］、抗氧化［10］等作用。本實驗研究結果顯示，通過干預治療后，蘇木組和激素組尿蛋白定量均明顯低于模型組，提示蘇木可以減少MN蛋白尿，從而延緩腎病的進展;蘇木組血清ALB明顯高于模型組，表明蘇木能提高MN大鼠的血漿蛋白水平，其原因可能與減少蛋白尿，改善肝臟的白蛋白合成和增加白蛋白的攝入，從而提高了血漿白蛋白的水平有關;蘇木組病理改變程度明顯減輕，可見蘇木能抑制膜性腎病大鼠的系膜細胞增生，減少免疫復合物形成，從而延緩腎小球硬化和腎間質纖維化的進程;此外，還可能通過增加腎血流量，提高腎小球濾過率，改善其微循環，或部分調節組織的修復與再生，從而修復部分受損腎臟組織。本實驗發現，模型組IL－18水平顯著升高，與各治療組存在顯著差異，而蘇木組與其他治療組之間IL－18的表達并無明顯差異，說明三種治療均具有抑制IL－18分泌的作用，蘇木與強的松組、雷公藤多甙相比并無優勢。而蘇木抑制IL－18分泌的作用具體機制尚不明確，需要進一步的探索與研究。

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