納米中藥對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎IL－1β、IL－6、IL－8影響的實(shí)驗(yàn)研究

趙巴根那，董華，董清平

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.黑龍江公安消防醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150090;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于血尿酸升高導(dǎo)致尿酸鈉在關(guān)節(jié)內(nèi)形成微晶體沉淀，而引起的非特異性關(guān)節(jié)炎。是痛風(fēng)典型的表現(xiàn)形式，急性期具有驟然發(fā)病和劇烈疼痛的特征，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛，多數(shù)患者的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為發(fā)作與緩解交替，病程長(zhǎng)者發(fā)作期長(zhǎng)而緩解期短，甚至有的患者遷延不愈。反復(fù)發(fā)作的患者在病變部位可形成痛風(fēng)石，關(guān)節(jié)畸形等。

本課題所要研究之方藥是作者根據(jù)中醫(yī)理論，結(jié)合多年治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎驗(yàn)方基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥研究成果研究出的中藥外用方劑，臨床應(yīng)用多年，顯示出良好的抗炎，消腫及鎮(zhèn)痛作用。本課題通過(guò)納米粉碎技術(shù)將中藥制成納米顆粒，外敷于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠病變部位，觀察創(chuàng)新中藥劑型與傳統(tǒng)中藥外敷劑型相比對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎 IL－1β、IL－6、IL－8表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)大鼠40只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

大鼠IL－1β定量ELISA試劑盒(美國(guó)RD公司進(jìn)口分裝);大鼠IL－6定量ELISA試劑盒(美國(guó)RD公司進(jìn)口分裝);大鼠IL－8定量ELISA試劑盒(美國(guó)RD公司進(jìn)口分裝);扶他林(北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥H19990291)。

1.3 主要儀器

DF－110型電子分析天平;LD25－2型自動(dòng)平衡離心機(jī);上海一恒電熱恒溫箱;醫(yī)用微波爐;RJ17－DG 5031酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)用藥

傳統(tǒng)中藥(由元胡、當(dāng)歸、川芎、威靈仙、冰片等組成)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第附屬第一醫(yī)院制劑室進(jìn)行普通級(jí)粉碎(80目)。精密稱取傳統(tǒng)中藥10g，加蒸餾水10ml混勻，制成均勻膏狀液體，密封，備用。

納米中藥(與傳統(tǒng)中藥藥物組成相同)由哈爾濱工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行納米級(jí)粉碎。并在透射電鏡下檢測(cè)其粒度達(dá)到100納米以下。制備方法同傳統(tǒng)中藥。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

將Wistar大鼠40只馴養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表分成5組，即空白組8只，模型組8只，扶他林組8只，傳統(tǒng)中藥組8只，納米中藥組8只。自由攝食，并定期清潔、消毒。

2.2 模型制作及給藥方法

模型制作:用6號(hào)注射針在受試大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45°方向刺入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.2ml尿酸鈉溶液(濃度2.5g/100ml)注入到踝關(guān)節(jié)腔，形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

空白組:不造模，不用藥;模型組:只造模，不用藥;扶他林組:造模后用扶他林軟膏外敷踝關(guān)節(jié)處，用膠布固定，每日1次，連續(xù)5天;傳統(tǒng)中藥組:造模后用普通級(jí)粉碎的中藥膏外敷踝關(guān)節(jié)，用膠布固定，每日1次，連續(xù)5天;納米中藥組:造模后用納米中藥膏外敷踝關(guān)節(jié)，用膠布固定，每日1次，連續(xù)5天。

2.3 標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)方法

以上各組在第3天和第5天每組各取8只，關(guān)節(jié)腔剖開(kāi)，切取關(guān)節(jié)滑膜，按比例加生理鹽水稀釋，放入組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，離心，取上清液，于－70℃冰箱保存待檢測(cè)IL－1、IL－6、IL－8、TNF－α含量。用酶聯(lián)免疫法測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

各組大鼠給藥前，皮毛光澤色白，精神佳，好動(dòng)，飲食正常;造模后，模型組大鼠局部關(guān)節(jié)皮膚紅腫，活動(dòng)減少，攝食及飲水次數(shù)也明顯減少;其他各組大鼠活動(dòng)、攝食、飲水與平時(shí)略少，但比模型組好。

3.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL－1β的含量變化

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL－1β的含量比較(s，pg/ml)

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜IL－1β的含量比較(s，pg/ml)

注:與空白組比較，*P＜0.01;治療組與模型組比較，☆P＜0.01，納米中藥組與扶他林組比較，▲P＜0.05;與傳統(tǒng)中藥組比較，★P＜0.05。

組別 n 第3天 第5天空白組8 96.18 ±3.39 95.91 ±3.34模型組 8 142.89 ±4.27* 133.84 ±4.01*扶他林組 8 127.67±3.58＊☆ 109.74±3.25＊☆傳統(tǒng)中藥組 8 127.82±4.03＊☆ 110.99±3.32＊☆納米中藥組 8 111.78±3.72＊☆▲★ 96.45±3.63☆▲★

空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜IL－1β的含量較少，模型組與空白組比較IL－1β的含量明顯增多，第3、5天均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明造模成功。第3、5天，治療各組IL－1β與模型組比較，關(guān)節(jié)滑膜中IL－1β含量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明各治療組均有降低大鼠足踝關(guān)節(jié)組織中IL－1β含量的作用。治療第3、5天，納米中藥組與扶他林組及傳統(tǒng)中藥組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療各時(shí)間點(diǎn)，扶他林組與傳統(tǒng)中藥組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明納米中藥組對(duì)降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中細(xì)胞因子IL－1β作用優(yōu)于扶他林組及傳統(tǒng)中藥組。

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞因子IL－6的含量見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL－6的含量比較(s，pg/ml)

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL－6的含量比較(s，pg/ml)

注:與空白組比較，*P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.01;納米中藥組與扶他林組比較，▲P＜0.05;與傳統(tǒng)中藥組比較，★P＜0.05。

組別 n 第3天 第5天空白組8 135.93 ±4.69 136.12 ±3.62模型組 8 170.41 ±3.85* 167.28 ±2.85*扶他林組 8 160.90±4.01＊☆ 151.39±3.06＊☆傳統(tǒng)中藥組 8 162.12±3.47＊☆ 153.05±3.19＊☆納米中藥組 8 152.93±3.35＊☆▲★ 140.85±2.17☆▲★

空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IL－6的含量較少，模型組含量較高，第3、5天，治療各組IL－6含量均呈下降趨勢(shì)，與模型組比較，大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中IL－6含量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明各治療組均有降低大鼠足踝關(guān)節(jié)滑膜中IL－6含量的作用。治療第3、5天，納米中藥組與扶他林組及傳統(tǒng)中藥組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療各時(shí)間點(diǎn)，扶他林組與傳統(tǒng)中藥組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞因子IL－8的含量

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞因子IL－8的含量比較(s，pg/ml)

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞因子IL－8的含量比較(s，pg/ml)

注:治療組與空白組比較，*P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.01;納米中藥組與扶他林組比較，▲P＜0.05;與傳統(tǒng)中藥組比較，★P＜0.05。

組別 n 第3天 第5天空白組8 60.95 ±3.26 61.02 ±2.61模型組 8 127.84 ±3.71* 119.90 ±4.56*扶他林組 8 99.69±4.65＊☆ 84.99±5.22＊☆傳統(tǒng)中藥組 8 100.59 ±3.54＊☆ 86.25 ±4.27＊☆納米中藥組 8 89.45±2.94＊☆▲★ 67.37±3.78☆▲★

空白組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中IL－8的含量較少，模型組與空白組比較IL－8的含量明顯增多，第3、5天，治療組與模型組比較，大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中IL－8含量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明各治療組均有降低大鼠足踝關(guān)節(jié)滑膜中IL－8含量的作用。治療第3、5天，納米中藥組與扶他林組及傳統(tǒng)中藥組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療各時(shí)間點(diǎn)，扶他林組與傳統(tǒng)中藥組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明納米中藥組對(duì)降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中IL－8的作用優(yōu)于扶他林組及傳統(tǒng)中藥組。

4 討論

體內(nèi)的尿酸鈉鹽結(jié)晶(MUS)作用于血小板、中性粒細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核細(xì)胞，刺激上述細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，這些炎性細(xì)胞因子在痛風(fēng)發(fā)病的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL－1β、IL－8作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，認(rèn)為IL－1β是前炎癥網(wǎng)鏈中的一級(jí)細(xì)胞因子，而IL－8是由IL－1β、TNF－α誘導(dǎo)的二級(jí)前炎癥細(xì)胞因子［2］。多種細(xì)胞因子參與了關(guān)節(jié)炎的發(fā)作，尤其是IL－1β、IL－6和IL－8。本實(shí)驗(yàn)用尿酸鈉混懸液誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，在觀察的5天中，模型組踝關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞因子 IL－1β、IL－6、IL－8均有較高含量存在，表明細(xì)胞因子 IL－1β、IL－6、IL－8在MSUC誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中起重要作用。通過(guò)分析這些細(xì)胞因子含量的變化，對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同藥物療效進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，納米中藥通過(guò)降低IL－1β、IL－6、IL－8等細(xì)胞因子是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的可能的機(jī)制之一。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)的發(fā)生，是本虛標(biāo)實(shí)之證，脾腎雙虧為本，濕、熱、痰、濁、毒凝滯為標(biāo)。以濕濁內(nèi)盛為主要病機(jī)。在急性期以濕熱濁毒閉阻經(jīng)脈、流注關(guān)節(jié)為主。治療重在清熱解毒、利濕瀉濁化瘀通絡(luò)［3－4］。本課題所要研究之方藥是作者根據(jù)中醫(yī)理論，結(jié)合多年治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎驗(yàn)方基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)透皮吸收理論研究出的中藥外用方劑［5］。納米中藥貼劑由元胡、當(dāng)歸、威靈仙、川芎、冰片等各等分組成。威靈仙為君藥，威靈仙，味辛具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)之功效，針對(duì)痛風(fēng)濕郁絡(luò)瘀，不通則痛的病機(jī)特點(diǎn)，用其除濕、通絡(luò)、止痛之功。威靈仙還有的白頭翁素和白頭翁醇皂甙等能增加尿酸鹽 排泄，具有鎮(zhèn)痛，抗痛風(fēng)作用。元胡為臣藥，味辛，具有行氣止痛之功，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，元胡具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。當(dāng)歸、川芎為佐藥，現(xiàn)代研究證明，其具有降低毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)透皮吸收、抗炎止痛的作用。冰片為使藥，味辛、苦，具有開(kāi)竅、清熱解毒之功效，引諸藥由表達(dá)里，現(xiàn)代研究表明，冰片具有抗炎止痛作用，又是很好的透皮促進(jìn)劑。本課題通過(guò)納米粉碎技術(shù)將治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的中藥加工成納米級(jí)粒子。增加藥物的吸收率與透入性。實(shí)驗(yàn)表明:運(yùn)用納米中藥貼敷透入療法的局部給藥途徑，較快發(fā)揮作用，緩解關(guān)節(jié)疼痛，是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)值得探討的課題。

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