阿卡波糖的研究進展

張瑞霞，楊鳳英，卓文海，徐寶興

(山東魯抗醫藥股份有限公司，山東 濟寧 272000)

20世紀70年代以來，糖尿病、高血糖等糖代謝疾病發病人數迅速增加，目前糖尿病已經被列為繼心血管、腫瘤之后的第三大致死性疾病，嚴重威脅著人類健康。糖尿病對生活質量的影響和巨大的醫療開支，促進了全社會對糖尿病的重視和對其多種治療手段的深入研究［1］。

阿卡波糖(Acarbose)是臨床常用的α－葡萄糖苷酶抑制劑，屬于2型糖尿病的常用藥物之一，它是一種生物合成的假性四糖，能抑制小腸壁細胞的α－糖苷酶活性，從而延緩腸道內寡糖、雙糖或多糖的降解，延緩葡萄糖和果糖的降解和吸收，以達到降低餐后血糖的效果［2］。由于具有良好的藥代動力學性質和低毒性，阿卡波糖成為理想的降糖藥物，本文從發酵、分離以及衍生物研究等方面對阿卡波糖的研究進展進行綜述。

1 阿卡波糖的發酵工藝研究

由于阿卡波糖的化學結構比較復雜，目前工業規模的生產主要是通過微生物發酵獲得的。阿卡波糖可從游動放線菌的發酵液中提取得到，其在微生物體內的合成代謝路徑以及發酵工藝研究一直是阿卡波糖的研究熱點之一。

1.1 碳源濃度的影響 阿卡波糖分子具有假性四糖結構，這表明其生物合成與碳源物質的分解代謝有著密切的關系，碳源濃度過高或過低都會影響菌體的生長和代謝，進而通過代謝物阻遏效應降低產物的濃度，影響微生物的正常生理代謝。因此，優化培養基中碳源的組成，對提高阿卡波糖的產量有重大的影響。

Choi BT等［3］在研究游動放線菌CKD－485－16發酵產阿卡波糖的過程中發現，葡萄糖和麥芽糖既是阿卡波糖的能源物質又是其合成的前體物質，葡萄糖在發酵早期就被耗盡，而麥芽糖在整個發酵過程中緩慢地被利用，并且在葡萄糖耗盡之后，充當能源物質。同時，因為麥芽糖會直接摻入阿卡波糖的結構中，所以葡萄糖在早期耗完之后，后期麥芽糖含量減少會顯著制約阿卡波糖的產量，因此必須嚴格控制葡萄糖的含量并保持麥芽糖在發酵液中的高濃度來促進阿卡波糖的合成。

程新等［4］人的研究結果表明，當發酵培養基和補料培養基中的碳源選用麥芽糖和葡萄糖，且其配比分別為3∶1和4∶1時，最利于阿卡波糖的合成。在游動放線菌A－5.6發酵過程中通過碳源的選擇和補加，使發酵液的總糖濃度保持在合適的水平，可以大幅提高阿卡波糖的產量。

葉亞健等［5］對阿卡波糖產生菌游動放線菌A－5.6的發酵進行了研究，并進行了30 m3罐發酵放大。通過搖瓶分批補料發酵，表明補料培養基中麥芽糖和葡萄糖配比對阿卡波糖的合成具有顯著的影響，且麥芽糖和葡萄糖的配比為3∶1最利于阿卡波糖合成;在此基礎上，在100 L發酵罐上進一步考察了碳源對阿卡波糖發酵的影響，結果表明，補料階段的發酵液總糖和還原糖濃度分別控制在75～80g·L－1和45～50g·L－1時，最利于阿卡波糖合成。

1.2 氮源濃度的影響 張琴等［6］通過對游動放線菌LAH6采用紫外、亞硝基胍、硫酸二乙酯和亞硝酸等方法進行誘變，篩選到一株高產突變株SIPI－AK，且雜質含量明顯降低，通過進一步優化發酵培養基和10 L發酵罐的補料工藝，發酵單位達到3130 μg·mL－1。該研究同時發現阿卡波糖的生物合成與補料培養基中氮源的種類和比例有密切關系，在發酵過程中補入谷氨酸鈉并維持一定含量，不僅能大幅提高阿卡波糖的發酵單位，還能適當降低雜質C組分的產生，此補料工藝可供工業生產提高阿卡波糖發酵水平做參考。

1.3 滲透壓的影響 在阿卡波糖的發酵過程中，滲透壓對其產量有著決定性的作用。一方面由于在阿卡波糖的生物合成中麥芽糖可直接摻入阿卡波糖的分子結構中，提高培養液的滲透壓，可促進麥芽糖向細胞內運輸，從而提高阿卡波糖的產率;另一方面，碳源濃度過高會使培養基的滲透壓過高，影響菌體的生長和代謝，產生分解代謝物阻遏效應，降低產物的濃度。因此，在發酵過程中，要嚴格控制培養基的組成及滲透壓。

Beunink J等［7］利用游動放線菌 SE50/10合成阿卡波糖，發現阿卡波糖的產量與培養液的滲透壓有著密切的關系。最適宜的滲透壓值為400 mOsm·kg－1，高于或低于該值，阿卡波糖的產量都會下降，滲透壓過高或過低時，甚至沒有阿卡波糖的生成。一般情況下低滲透壓不會對微生物的生長及代謝造成嚴重影響，但是卻能嚴重影響阿卡波糖的合成。

1.4 用阿卡波糖的類似物抑制阿卡波糖向副產物組分C的轉化 在合成阿卡波糖的同時，還會形成一系列阿卡波糖的同系物，如組分A、組分C等，藥典對這些雜質的含量有著嚴格的限制，因此如果能夠降低發酵液中副產物的含量，將大幅降低阿卡波糖臨床用藥的生產成本。

發酵液中副產物組分A和C是由阿卡波糖直接轉化而來的，其分子結構與阿卡波糖非常相似，不僅影響阿卡波糖的產率而且增加了阿卡波糖純化的難度。因此，多年來，人們積極尋求新的措施來減少阿卡波糖向組分A和C的轉化。最近的研究表明［8］，在Actinoplanes sp.內組分C的形成是阿卡波糖在海藻糖合成酶(TreY)的異構化作用下產生的，由于在細胞內還存在另外的海藻糖合成途徑，如TreS和TpS1，因此如果將TreY定點突變，則可以在不影響細胞對海藻糖的利用的情況下大幅降低組分C的含量。

此外，研究還發現［9］，在游動放線菌的發酵液中存在一系列的阿卡波糖類似物，由于與阿卡波糖的結構相似，所以可充當催化這一轉化反應的酶的競爭性抑制劑，并且都顯示了明顯的抑制作用。在以游動放線菌CKD－485－16作阿卡波糖產生菌時，加入抑制劑可以明顯的降低組分C的含量，使阿卡波糖的產量得到顯著提高。據報道［10］，如果在發酵早期加入微量的阿卡波糖競爭性抑制劑，可以使組分C的含量減少31%～92%。

2 阿卡波糖的分離工藝研究

近年來，對阿卡波糖提取工藝的研究報道日益增多。九十年代國外一般用樹脂進行分離提取，利用阿卡波糖結構中一個－NH－基所表現出弱堿性的特點，可利用離子交換樹脂對其進行分離純化;Lin CL等［11］的報道中提出利用阿卡波糖在乙醇中沉淀的特點，采用醇沉法進行初步分離后，再用強酸性陽離子交換樹脂和親和色譜法進行純化精制，最后得到的阿卡波糖純度高達98%。

近幾年國內的分離純化研究也已形成規模，采用了另一種新技術—膜過濾系統［12］，幾篇專利中都涉及了此項技術。三達膜科技有限公司［13］將阿卡波糖的發酵液直接用一級膜分離系統，去除菌絲體、可溶性蛋白、培養基及部分色素，得到澄清的阿卡波糖濾液，再用二級膜分離系統進一步濃縮，并脫鹽脫色，去除部分單糖、大量的無機鹽等小分子雜質，然后再利用層析樹脂來純化可得到高純度的阿卡波糖，此項技術雖然簡單方便，但成本高，不適于工業生產。另外，浙江海正藥業股份有限公司［14］采用傳統的離子交換樹脂分離純化阿卡波糖，再用膜過濾器除去無機鹽、低分子等有機雜質，也可得到高純度的阿卡波糖，此法已被廣泛應用。

王仙菊等［15］通過對阿卡波糖產生菌游動放線菌Actinoplanes sp.AC－5進行研究，對其菌絲片段進行超聲波斷裂和紫外線誘導處理，得到了高產菌株，通過斜面培養、種子培養、搖瓶發酵得到阿卡波糖發酵液，利用膜分離技術，結合樹脂吸附工藝，將阿卡波糖從含有殘余鹽類、有色物質和其他大分子雜質的發酵液中提純出來，極大地提高了阿卡波糖的提取收率和純度，且生產成本低，環境污染少，值得進一步推廣應用。

3 阿卡波糖的衍生物研究

利用酶對阿卡波糖的碳側鏈兩端進行修飾，可得到對碳水化合物水解酶抑制能力更強的阿卡波糖衍生物，目前除了阿卡波糖廣泛應用于糖尿病臨床治療以外，阿卡波糖的衍生物也日益引起人們的研究興趣，研究結果表明［16～20］，通過生物合成－酶學修飾的方法對阿卡波糖進行改造，可以得到更加有效的糖代謝類疾病治療藥物。

Yoon等［16～18］研究發現，利用 Actinoplanes sp.發酵或CGTase、葡聚糖蔗糖酶的轉糖基作用將麥芽糖末端連接到阿卡波糖的非還原性末端以得到的阿卡波糖類似物，對水解酶的抑制能力相較阿卡波糖有大幅度的提高;通過CGTase作用于阿卡波糖，將麥芽六糖、麥芽八糖、麥芽十糖結合在Valienamine的C4－OH位置上，得到的阿卡波糖衍生物對α－淀粉酶抑制能力比阿卡波糖高出1～3個數量級;在L.mesenteroides B－512FMC和 B－742CB發酵過程中，利用葡聚糖蔗糖酶將α－D－葡萄糖連接到環己烯鏈或2－羥基環的還原性末端，通過轉糖基反應連接一分子D－葡萄糖以后，得到的acarviosine－葡萄糖對α－葡萄糖苷酶的抑制作用相對于阿卡波糖提高了430倍。

Lee等［19］用纖維二糖和乳糖連接到阿卡波糖的環己烯鏈或2－羥基環的還原性末端，得到的衍生物對β－葡萄糖苷酶和β－半乳糖苷酶具有抑制作用，而阿卡波糖則對其無抑制作用;另外，將阿卡波糖分子內的麥芽糖用異麥芽糖取代后得到的衍生物對豬胰淀粉酶(PPA)的抑制能力是阿卡波糖的15.2倍。Nam SH 等［20］用 Leuconostoc mesenteroides B－512 FMC發酵得到一種新型的阿卡波糖類似物，利用果聚糖蔗酶將果糖連接在阿卡波糖的末端，形成D－呋喃果糖基，而不是單一的D－葡萄糖。與阿卡波糖相比，阿卡波糖－果糖苷能夠同時抑制兩個α－葡糖苷酶和兩個α－淀粉酶，并且對α－葡糖苷酶和α－淀粉酶的抑制作用分別是阿卡波糖的1.12倍和1.52倍，此外，阿卡波糖－果糖苷還能夠同時作用于多種葡聚糖蔗糖酶。

4 不足與展望

阿卡波糖具有良好的降低餐后血糖的作用，在2型糖尿病的治療中具有可靠的臨床療效，但其市售價格高且存在一定的副反應，一定程度上限制了其普及應用。由于菌株在阿卡波糖的生產過程中會形成一系列的阿卡波糖的同系物影響產率，因此，如果能從基因層面詳細闡明其合成機理，將會大幅度提高阿卡波糖的純度，降低生產成本。此外，從發酵液中分離出活性單體，通過化學修飾和基團改造制備活性更強的阿卡波糖衍生物，以進一步研發出更為安全有效的糖尿病治療藥物將成為阿卡波糖的研究熱點。

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