水產品中四環素類藥物殘留檢測方法研究

李紅梅，鄒 潔，楊建濤，李潔莉，尤繼明，徐德寧，韓 華，楊抗震

（1.江蘇省寶應縣產品質量監督檢驗所，江蘇 寶應225800；2.國家有機食品質量監督檢驗中心，江蘇 寶應225800；3.江蘇省產品質量監督檢驗研究院，江蘇 南京210029；4.河南農業大學 林學院環境系，河南 鄭州450002）

1 引言

四環素類抗生素（tetracycline antibiotics）是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，由于實用性高且價格低廉，在畜禽養殖和飼料添加劑等方面得到了廣泛的應用。近年來，我國的養殖業發展步伐加快，水產業發展迅速，水產品總量連續幾年居世界第一，2005年產量已超過4 000萬t[1～4]。隨著集約化水產業的發展，魚類疾病也越來越復雜，魚藥和抗生素飼料添加劑的使用量也日漸增加，由于濫用藥物，導致了漁藥大量殘留，嚴重影響了水產品的質量安全。因此，為了保障水產品質量安全，消除貿易壁壘，就必須加快對藥物殘留分析方法的研究。為此本文對水產品中四環素類藥物殘留的檢測方法進行了分析研究。

目前，四環素類抗生素殘留檢測方法很多，大致分為3類，一是生物測定法[5～7]，包括微生物測定法（microbiological assay）、放射受體測定法（redio receptor assay）等；二是儀器分析法[8～20]，包括波譜分析、紫外分析，熒光分析，高效液相色譜分析，氣相色譜分析，液質聯用分析等；三是免疫分析法[21，22]，包括酶聯免疫測定法（EIA，ELISA）、膠體金免疫層析法等。

2 微生物測定法

微生物測定法是目前公認而又廣泛應用于測定抗生素的測定方法，也是目前我國藥典中引用的標準方法，主要有紙片擴散法、微生物管碟法、E～test法等。

2.1 紙片擴散法

紙片擴散法（paper disc，簡稱PD法），是依據抗生素能夠抑制微生物的生長繁殖這一特性而設計的[5，6]。其原理就是將樣品提取液加一定量在紙片上，并貼在菌生長的培養基上，一段時間后測其抑菌圈的大小。如果水產品中存在抗生素殘留，則其樣品提取液可以抑制微生物的生長；反之則微生物的生長不會受到抑制，而水產品中抗生素殘留的多少則可以根據對微生物的抑制程度來判斷。

2.2 管碟法

管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法[1]，利用管碟法測定抗生素效價，具有準確、直觀、重復性好等優點，因而被廣泛采用。其基本原理同PD法，利用抗生素在攤布特定實驗菌的固體培養基內呈球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區，抑制了實驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈。根據抗生素在一定濃度范圍內，對數劑量與抑菌圈直徑（面積）呈線性關系，比較標準品與供試品兩者對接種的實驗菌產生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價[7]。但整個試驗過程中影響結果的因素很多，任何一個環節的操作不當就會造成很大誤差，導致整組試驗失敗。

微生物法雖然原理及操作簡單，費用低，一般實驗室都能操作，但是測定所花的時間太長，靈敏度低，結果誤差較大。在測定時樣品需在pH值為4.5的條件下培育3～4h，而有些抗生素，例如土霉素、四環素在酸性條件下易發生差向異構化，形成異構體難于分離，而其抗菌活性減弱或完全消失，限制了此方法的使用。

3 儀器分析法

目前，水產品中四環素類藥物殘留的常用的儀器檢測方法主要有液相色譜法（HPLC）及液相色譜～串聯質譜法（LC～MS/MS）。

3.1 液相色譜分析法

高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于藥物殘留的分析檢測。

袁冬梅等[12]采用乙酸乙酯（1mol/L）＋乙酸鎂（0.005mol/L）＋EDTA（0.001mol/L）的混合液提取樣品，并用此混合液和甲醇以72：28（V/V）作為流動相分離土霉素、金霉素和四環素，最低檢出限分別為0.013mg/g、0.016mg/g、0.014mg/g。

徐傳梅[13]等采用CaCl2衍生化，樣品經5%HClO4除蛋白后，離心過濾。采用 Waters XTerra RP18（5μm，4.6×150mm）色譜柱，以 V（甲醇）∶V（CaCl2緩沖液）＝30∶70（pH 值為6.6）為流動相，等度洗脫，流速0.8mL/min，柱溫25℃。經CaCl2緩沖液衍生化，在激發波長（Zx）350nm和發射波長（Zm）520nm處檢測土霉素、四環素和金霉素的殘留量，土霉素的最小檢測限為1.48ng/mL，四環素為1.20ng/mL，金霉素為2.32ng/mL。

黃志勇[14]等人采用4%高氯酸溶液提取樣品中的殘留抗生素，經濃縮處理，以乙腈和0.01mol/L NaH2PO4（18∶82，v/v）為流動相，流速1mL/min，3種抗生素組分峰能與雜質峰完全分開，檢測波長為355mm，最低檢出限為0.08mg/g。

北京化工大學的王覃[15]等人以醋酸銨～醋酸/水緩沖液和乙腈作為流動相，通過二元梯度洗脫，使海產品中四環素類抗生素得到了較好的分離，最低檢出限在15～32mg/kg。

浙江任一平[16]等人用高效液相色色譜對動物性食品中土霉素和四環素進行測定，樣品經含乙二胺四乙酸二鈉的丁二酸鈉緩沖液除蛋白后，由SPE～C18小柱提純凈化，經ODS～C18柱分離后，用8%氫氧化鋯溶液柱后衍生，與鋯離子的螯合物在激發波長（EX）：406nm 和發射波長（Em）：515nm 處檢測，土霉素和四環素的最低檢出限為3mg/L和4mg/L。

楊挺[17]等人建立了一種高效液相色譜法測定水產品中土霉素、四環素、去甲基金霉素、金霉素、脫氧土霉素的分析方法。樣品用5.0%高氯酸溶液提取，上清液用Oasis HLB固相萃取柱凈化，用紫外檢測器于355nm測定。土霉素、四環素、去甲基金霉素檢測限為0.01mg/kg，金霉素、脫氧土霉素檢出限為0.02mg/kg。

從上面高效液相色譜檢測方法來看，樣品前處理多采用高氯酸等強酸或者MCI緩沖液提取，經固相萃取柱（C18或者HLB）凈化后，儀器柱后衍生檢測[2]。四環素類抗生素在酸性和堿性條件下均不穩定，四環素類藥物中含有許多羥基、烯醇羥基及羰基，在中性條件下能與多種金屬離子形成不溶性螯合物，儀器檢測時候會出現幾個峰，通過保留時間不易對結果進行判斷，容易出現假陽性；而且緩沖溶液配制較為復雜，樣品要經過固相萃取凈化，前處理比較復雜，而且利用復雜的緩沖鹽對儀器柱子的壽命有很大的影響，加上儀器分析技術的局限，難以適應大量復雜樣品和現場快速檢測的需要。

3.2 液質聯用分析法

近年來，隨著液質的普遍應用，由于其更加可靠，定量更加靈敏準確，能夠去除假陽性干擾，特異性強，液質聯用（LC～MS/MS）技術愈來愈多的應用于獸藥殘留的確證檢測。

劉艷萍[18]等人用高效液相色譜～串聯質譜法測定水產品中的4種四環素類藥物殘留量，以MTC緩沖液提取水產品中的四環素類殘留物，經HLB固相萃取柱凈化，采用LC～MS/MS選擇反應監測（SRM）正離子模式測定，可一次對水產品中的四環素、土霉素、金霉素和強力霉素進行定性和定量。4種物質最低檢出限均可達到2.0μg/kg。

洪武興[19]等人用液質聯用法檢測水產品中四環素類殘留，樣品利用乙酸乙腈提取，氮氣吹干，殘渣用乙腈水溶解后，加入正己烷去除脂肪等雜質，取乙腈水相過0.45μm濾膜上機檢測，采用子離子定量，四環素類藥物的檢測限均可達到20μg/kg。

林荊[20]等人用超高效液相色譜～串聯質譜（UPLC～MS/MS）法測定水產品中6種四環素。樣品粉碎后，用0.01mol/L Na2EDTA～Mcllvaine磷酸鹽緩沖溶液提取，樣液過濾后正己烷除脂，經Oasis HLB固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，氮氣吹干緩沖液定容后，用反相液相色譜分離，電噴霧正離子模式離子化，用多反應監測模式（MRM）監測，三重四級桿質譜測定，外標法定量。該法對四環素類藥物在5.0～50.0μg/kg范圍內呈線性關系，相關系數r在0.996 9～0.999 9之間，在5.0、10.0、25.0、50.0μg/kg添加水平，回收率為61%～97%，相對標準偏差（RSD）為1.3%～5.7%，其檢出限達2.5μg/kg。

液相色譜～串聯質譜儀法測定水產品中四環素類藥物殘留，由于以子離子和母離子定性和定量，消除了假陽性，而且樣品前處理比液相色譜簡單，操作簡便，穩定性好，選擇性好，靈敏度高，檢出限低，能夠達到歐盟和日本等國家對進口水產品最高殘留量的要求。

液質聯用法的缺點就是儀器比較昂貴，對人員要求比較高，技術復雜，使用起來費用比較高，普遍性較差，但是隨著社會的發展，利用液質聯用法檢測獸藥殘留是將是未來的發展趨勢。

4 免疫分析法

4.1 酶聯免疫法

酶聯免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯免疫法，或者ELISA法[21]。它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。酶聯免疫試劑盒是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分去除。自從Engvall和Perlman（1971）首次報道建立ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）（Enzyme～Linked ImmunosorbentAssays，ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）以來，由于ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優點，使其得到迅速的發展和廣泛應用。

四環素類藥物殘留檢測試劑盒能在短時間內進行大批量樣品的篩選，又不需要復雜昂貴的大型儀器，具有特異性強、靈敏度高、樣品預處理簡單等優點。我國農業部1025號公告～20～2008中動物性食品中四環素類藥物殘留檢測采用的是酶聯免疫吸附法。

4.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法即時檢驗技術（或稱“側流免疫層析技術”和“免疫膠體金技術”等）是20世紀90年代以來在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術。近年來發展迅速，目前已經在農業、畜牧業、環境檢測、尤其是在家庭自檢領域得到了廣泛應用。

四環素類藥物為廣譜抑菌劑，高濃度時具殺菌作用。其作用機制在于藥物能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結合，阻止氨基酰～tRNA在該位上的聯結，從而抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質的合成。

檀尊社[22]等人采用免疫競爭法，將抗四環素單克隆抗體～膠體金復合物包被在膠體金結合墊上，并將人工合成的四環素抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線（線），其殘留藥物與待測樣品中四環素競爭結合膠體金標記的四環素單克隆抗體，最終能以顏色直觀顯示檢測結果。檢測水產品試樣時，試劑靈敏度最低值可達100ng/mL，僅需5～10min，與金霉素、土霉素、強力霉素等四環素族抗生素有很強的交叉反應，故可同時檢測四環素族中幾種主要抗生素，而與沙丁胺醇、萊克多巴胺等其他獸藥無交叉反應。操作方便，僅需配備小型離心機，檢測成本低廉。

免疫方法能夠在短時間內進行大批量樣品的篩選，又不需要復雜昂貴的大型儀器，具有特異性強、靈敏度高、樣品預處理簡單等優點。但是對于藥殘檢測試劑盒的研發相對遲緩，免疫法對實驗室溫度、光線、使用溶劑要求較高，而且試劑盒使用起來比較昂貴，限制了其普遍應用。

5 問題和展望

微生物法是最早用于四環素類藥物殘留檢測的方法之一。微生物法測定四環素類抗生素，在實驗中發現抑菌圈不是很規則，直徑大小不一致，由此計算并繪制出的濃度曲線不準確，導致最終得出的樣液測定結果不準確，所以該種方法只能用于定性試驗。

液相色譜法靈敏度能夠達到要求，是現階段普遍采用的方法之一，但是前處理比較復雜，用的試劑都是有機試劑，容易污染環境，對人體造成傷害，而且四環素類藥物在酸性和堿性條件下容易發生異構化，在儀器上檢測容易出現假陽性。液質聯用法前處理比較簡單，耗時少，靈敏度高，檢出限低，滿足檢測要求，是未來的發展趨勢。

酶聯免疫試劑盒的研制在我國還是比較落后的，隨著技術的提高，酶聯免疫試劑盒測定藥物殘留能夠大大提高檢測效率和滿足多樣品的同時檢測。隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，使其更為簡便實用，因此標準化免疫法能夠成為藥物殘留的快速檢測方法。

6 結語

水產品中四環素類殘留是涉及人類健康的問題，應加強檢測工作，提高檢測效率，降低檢測成本，并努力研究發展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術，普及廣大企業的出廠檢驗，如試劑盒檢測；發展高效、高靈敏的聯用技術和多殘留組分確證技術，如LC～MS/MS；實現分析過程自動化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保證消費者的健康。

[1]孔凡真.我國肉類企業的現狀與展望[J].山東食品科技，2004，6（5）：3～5.

[2]郭 霞，王慶賀，王 申，等.水產品中四環素類抗生素殘留檢測方法的比較和探討[J].水產科技情報，2008，35（3）：129～132.

[3]Masahiko T，Shigeki D，Taketoshi N.Determination of chloramphenicol residues in fish meats by liquid chromatography～atmospheric pressure photoionization mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2003（1011）：67～75.

[4]Pascal M，Veronique P，Eric G.Determination of the antibiotic chloramphenicol in meat and seafood products by liquid chromatography～electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2003（994）：75 ～ 84.

[5]鄧 斌，鄧春來，張 曦.牛奶中抗生素殘留及其檢測方法研究進展[J].飼料安全，2002，（24）：19～22.

[6]陳 宏.水產品中幾種常見漁藥殘留檢測方法的研究[J].科技創新導報，2009，18：255～256.

[7]任董春.淺談抗生素微生物檢定～管碟法操作注意要點[J].安徽醫藥，2003，7（3）：230.

[8]陳士恩，程燕平，阿依木古麗，等.固相萃取～高效液相色譜檢測牛肉中四環素類抗生素殘留[J].西北民族大學學報：自然科學版，2011，81（32）：62～67

[9]陸 梅，高 翔，李淑文.高效液相色譜法測定水產品中四環素類抗生素殘留[J].環境監測管理與技術，2008，5（20）：38～39.

[10]劉 麗，蔡志斌，張 英.高效液相色譜法測定水產品中土霉素、四環素、金霉素[J].中國衛生檢驗雜志，2007，8（17）：1 405～1 406.

[11]吉彩霓，岳振峰，謝麗琪，等.高效液相色譜法同時檢測水產品中7種四環素類抗生素殘留的研究[J].中國獸醫科技，2005，35（10）：820～826.

[12]袁冬梅，李一婧.養殖水產品中四環素類抗生素殘留的高效液相色譜測定法[J].食品工業科技，2008，29（01）：281～285.

[13]許傳梅，星玉秀，董 琦，等.肉類及水產品中四環素類抗生素殘留量的高效液相色譜測定方法[J].分析實驗室，2007，12（26）：258～260.

[14]黃志勇，蔡洪基，黃高凌，等.水產品中四環素類抗生素殘留量的高效液相色譜測定方法[J].福建分析測試，2005，14（1）：2 093～2 105.

[15]王 覃，陳大舟，湯 燁，等.高效液相色譜法同時測定海產品中四種抗生素的分析方法[J].北京化工大學學報，2006，5（33）：90～93.

[16]任一平，徐 威，黃百芬.用柱后衍生熒光測定法檢測食品中土霉素和四環素殘留[J].浙江科技學院學報，2003，11（15）：50～53.

[17]楊 挺，王立君，趙 健，等.高效液相色譜法測定水產品中四環素類抗生素殘留[J].化學分析計量，2007，2（16）：35～36.

[18]劉艷萍，冷凱良，王清印，等.高效液相色譜～串聯質譜法測定水產品中的4種四環素類藥物殘留量[J].研究學報，2009，4（33）：34～39.

[19]洪武興，孫良娟，劉益峰，等.液質聯用法檢測水產品中四環素類殘留[J].現代食品科技，2010，7（26）：756～758.

[20]林 荊，張金虎，鄭 宇，等.水產品中四環素類藥物殘留的超高效液相色譜～串聯質譜法測定[J].食品科學，2010，20（31）：286～289.

[21]李亞琳，張俊升，王欽暉.酶聯免疫法測定牛奶中四環素類藥物的殘留量[J].云南畜牧獸醫，2005（2）：27.

[22]檀尊社，陸 恒，邵 偉，等.膠體金免疫層析法快速檢測水產品中四環素類藥物殘留[J].西北農業學報，2010，19（8）：32～37.