冬棗基因改良的研究

高秋名

（山東省濱州市高新區小營街道辦事處林業站，山東 濱州 256623）

1 引言

冬棗是鮮食棗果中的珍品，作為我國特有的晚熟鮮食果品，具有很高的營養價值和市場開發前景。冬棗果肉富含人體所需的多種氨基酸和維生素，尤以維生素C含量最為豐富，同時還含有環磷酸腺苷和鳥磷酸腺苷等物質。冬棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6～7d，目前冬棗采后保鮮主要采用常溫、低溫、氣調、濕冷及冰溫、冷凍和防腐保鮮等方法，但果實出庫后品質不佳，貨架期也只有35d。如何在保持果品鮮食品質的前提下延長貯藏期，是果實遺傳改良中亟待解決的問題之一，基因工程技術的利用為此開辟了一條新途徑。

2 果樹遺傳轉化研究概況

果樹多為多年生木本植物，世代周期長、雜合性高、自交不親和與遺傳背景復雜等特點給木本果樹的有性雜交育種帶來重重困難。但無論從提高經濟價值的角度，還是從提高營養價值的角度來說，培育果樹新種質都具有重要意義。植物基因工程技術為果樹育種提供了新途徑，基因工程技術具有傳統育種不可比擬的優勢，包括定向改良植物性狀；多采用離體繁殖材料，取材不受季節限制，可大大縮短育種周期；利用基因工程技術對果樹進行遺傳改良，一旦獲得轉基因植株，且目的基因表達出所需性狀，即可通過組織培養、扦插或嫁接等無性繁殖方式對轉基因植株進行擴大繁殖，由于不通過有性繁殖，因而個體間性狀一致。由于棗樹組織培養植株再生的難度較大，缺少合適的再生體系，與其他果樹遺傳轉化相比進展緩慢。

2.1 果樹遺傳轉化受體系統

植物遺傳轉化的受體系統應具備高效穩定的再生能力，穩定的外植體來源、較高的遺傳穩定性和對選擇劑敏感等條件。目前，應用于植物遺傳轉化的受體系統包括直接分化芽系統、胚狀體受體系統、愈傷組織受體系統、原生質體受體系統和種質系統。在木本果樹上應用較多的為直接分化芽系統和胚狀體受體系統。直接分化芽系統的外植體細胞不經過愈傷組織的形成而直接分化不定芽，特別是由莖尖分生細胞建立的直接分化系統具有很好的遺傳穩定性。該方法更適于無性繁殖的果樹、花卉等。如在柑橘類的遺傳轉化中多采用莖段、胚軸等作為受體，通過誘導不定芽再生植株。

胚狀體受體系統在果樹遺傳轉化中應用較為廣泛；果樹上第一例獲得成功的報道，即是以核桃胚狀體細胞為受體再生出轉基因植株。

原生質體作為“裸露”的植物細胞同樣具有全能性，在適當的培養條件下可再生出植株，因此也是理想的遺傳轉化受體系統；而木本果樹原生質體再生植株周期長，技術難度大，因此，在果樹上以原生質體為受體進行遺傳轉化的報道較少。

種質系統是指以植物的生殖細胞，如花粉粒、卵細胞為受體細胞進行基因轉化的系統。果樹一般是高度雜合體，如果利用花粉粒、卵細胞為受體必經過純合加倍過程，這樣會導致原有優良性狀的丟失。

許多果樹建立高效的愈傷組織誘導體系比較困難，因此愈傷組織受體系統的應用受到了限制。從再生植株變異程度等角度比較而言，直接分化系統和胚狀體受體系統具有較大的優勢。因此，在外植體再生植株過程應盡量越過愈傷組織階段，通過直接分化不定芽或胚狀體途徑建立高效穩定的再生體系。

2.2 果樹遺傳轉化方法

2.2.1 農桿菌介導法

在眾多的植物轉基因方法中，農桿菌介導法以其簡便、高效和機制研究最為清楚等特點成為應用最廣泛的方法。大多數果樹對農桿菌感染敏感，此法的應用可收到良好效果。在農桿菌介導的果樹遺傳轉化中，農桿菌菌株和生長時期、植物受體的再生能力及基因型的依賴性是制約轉化效率的主要因素。在蘋果、柑橘、梨、蔓越桔和杏的研究中發現，EHA101及其衍生而來的菌株EHA105較LBA4404菌株具有更強的轉化能力。農桿菌介導植物細胞轉化時，只有感受態細胞即處于活躍代謝期或分裂期的細胞才能被轉化，因此在果樹遺傳轉化過程中經常采用預培養、創傷外植體等方法以獲得狀態良好的受體，從而提高轉化效率。Bondt等人發現，gus基因的瞬時表達和gus基因的穩定表達之間不呈現良好的相關性。

2.2.2 基因槍轟擊法

基因槍轟擊法是利用包被有外源DNA的金屬微粒，通過高速轟擊將外源基因導入植物細胞、組織和器官。Fitch等以番木瓜的合子胚為受體，通過基因槍轟擊法將番木瓜環斑病毒外殼蛋白（PRVCP）基因導入受體細胞，再生出轉基因植株。Bechker等以香蕉胚懸浮細胞為受體，利用基因搶轟擊法進行了轉化，獲得了轉基因植株。一些研究小組在基因槍轟擊法和農桿菌介導法配合使用上做了有益嘗試。Scorza等利用基因槍轟擊無核葡萄體細胞胚2次，然后將體細胞胚與農桿菌共培養，獲得了轉基因植株。May等以香蕉莖尖為受體，先用基因槍轟擊組織，造成微小創傷；再用農桿菌介導法導入gus基因，由轉化的莖尖分生組織細胞直接再生出植株。

2.2.3 其他方法

聚乙二醇誘導法、電穿孔法、硅碳纖維介導法等也在果樹遺傳轉化中應用。然而這些方法多以原生質體為受體。木本果樹原生質體再生植株周期長，難度大，并且再生植株變異率高，遺傳不穩定，因此在木本果樹的遺傳轉化中應用不多。

2.3 基因工程技術在果樹改良方面的應用

隨著基因工程技術的發展，利用轉基因技術改良果樹的工作日益受到重視，通過轉基因提高果樹抗病蟲害能力是主要內容之一。在蘋果上首次獲得成功的遺傳轉化就是將來自蘇云金芽抱桿菌的Bt毒蛋白基因轉入蘋果，得到了轉基因植株。提高果樹抗逆性的基因工程研究也取得了階段性成果，幾個研究小組分別獲得了耐鹽、抗冷的轉基因植株。Gao等分別將來自大腸桿菌的膽堿氧化酶（COD）基因和來自蘋果的依賴于NADP的6－磷酸山梨醇脫氫酶基因轉入日本柿，獲得了耐鹽的轉基因植株。Cervera等將酵母HAL2基因導入柑橘，也獲得了耐鹽性提高的轉基因植株。

在利用轉基因技術縮短果樹童期的研究也取得了較大進展，Pefia等將來自擬南芥的LEAFY和API基因導入甜橙和積橙，轉化植株表現出童期縮短和提早開花的特性，這種性狀可遺傳給后代，轉基因植株的實生苗也表現出童期縮短的性狀。

增強果實耐貯性方面的研究主要集中在減少乙烯合成量和延緩細胞壁降解等方面。Silvia等在草墓中表達果膠裂解酶的反義基因，轉基因植株的果實在色澤、大小、形狀和重量諸方面與對照植株的果實無明顯差異，但相對較硬，在后熟過程中硬度的降低速度也相對緩慢。果膠裂解酶基因的表達分析結果顯示，轉基因植株中的表達量約為對照株的70%。在44個轉基因植株中，有33株的產量低于對照，其原因有待研究。不過，從該結果可得出，在延緩果實軟化的基因工程中果膠裂解酶基因可看作是一個很好的候選基因。

3 ABA與果實成熟的調控

3.1 ABA在果實成熟過程中的作用

果實成熟是一個復雜的過程，會出現特異性成熟基因的表達和果實細胞代謝的變化，并受內部和外部多種因素的影響。根據果實成熟過程中是否有呼吸躍變，可將果實分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型。ABA在上述兩類果實的成熟過程中發揮著不同的調控作用。

在呼吸躍變型果實的成熟過程中，ABA可能作為果實“原初啟動信使”，通過影響果實乙烯合成來調控果實的成熟。陳昆松等發現，獼猴桃果實后熟過程中，ABA積累出現在果實后熟前期，而乙烯躍變發生在果實后熟中后期，乙烯加速了果實軟化的進程，但與軟化啟動過程無明顯關系，說明ABA在獼猴桃果實后熟過程中起著啟動和調控作用。陳尚武等的研究結果表明:蘋果果實發育后期及成熟期果實內源ABA濃度升高，成熟期果實乙烯合成速率與果實內源ABA濃度呈現明顯的正相關，用ABA合成抑制劑fluridone處理蘋果果實后，果實內源ABA濃度顯著降低，乙烯躍變推遲，推測ABA可能是蘋果果實成熟過程中位于乙烯上游的內源調控因子。

作為調控果實成熟的重要激素，ABA在非呼吸躍變型果實中起著比乙烯更為重要的作用。Oavies等使用生長素類似物處理葡萄果實，導致果實成熟啟動推遲2周，而ABA含量的增加也被相應的推遲，說明ABA對葡萄果實的成熟啟動起著重要作用。張有林等以葡萄和鮮棗為材料研究了果實采后貯期ABA含量的變化，發現用ABA合成抑制劑三碘苯甲酸處理葡萄和鮮棗果實，然后低溫貯藏，明顯抑制了ABA的形成，取得了良好的保鮮效果。另外，外源ABA處理能促進草毒提前成熟。這些結果表明:在非呼吸躍變型果實成熟過程中ABA起主導作用，ABA含量增長發生在果實成熟之前，可認為是ABA的增加誘發了果實成熟的啟動。

3.2 betA基因和als突變基因

在高等植物中，甜菜堿由膽堿經兩步氧化反應合成，分別由膽堿單加氧酶（CMO）和甜菜堿醛脫氫酶（BADH）催化；在哺乳動物和一些微生物中，則由膽堿脫氫酶（CDH）催化膽堿形成甜菜堿醛，再由BADH催化合成甜菜堿；還有一些微生物如球形節桿菌和滋養節桿菌中，膽堿可不經過甜菜堿醛而在膽堿氧化酶（COD）的催化下直接生成甜菜堿，到目前為止COD只在微生物中發現。大腸桿菌的CDH由betA基因編碼，能催化膽堿形成甜菜堿醛，也能催化甜菜堿醛脫氫產生甜菜堿，只是催化后一步的效率較低，即兼具膽堿單氧化物酶和甜菜堿醛脫氫酶的功能，這使轉移單一基因就可使植物合成甜菜堿成為可能。Lilius等（1996）將betA基因轉入煙草，轉基因植株的耐鹽性比對照植株有明顯提高。

20世紀80年代中期，人們已成功地從擬南芥和煙草的抗除草劑植株及野生型植株中克隆出als基因。Haughn等通過誘變技術得到表現除草劑抗性的擬南芥突變系。用野生型擬南芥als基因為探針從除草劑抗性株系的基因組文庫中分離到突變als基因。als基因編碼乙酞乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS），該酶是Leu，IIe和 Val合成途徑中的第一個酶，是磺酸脈類除草劑的靶酶。磺酞脈類除草劑是一類較新的廣譜性除草劑，其特性是高效和對哺乳動物的低毒性。細菌、真菌和高等植物都顯示了對這類除草劑的敏感性。哺乳動物并不利用分支氨基酸合成途徑，而是通過食物獲得分支氨基酸，因此磺酰脲類除草劑對哺乳動物是低毒或無毒的。由于突變的als基因對磺酰脲類除草劑的高抗性，以及磺酰脲類除草劑的廣譜高效性和對哺乳動物的低毒性，其已被應用于農作物的遺傳轉化研究中，培育抗除草劑作物已成為作物育種的一個重要方面。在果樹上，Yao等將突變的als基因轉入蘋果栽培種嘎娜，獲得的再生植株表現為對磺酞脈類除草劑的抗性。

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