體外熱原檢測法-人外周血單個核細胞法研究綜述

盧金鳳，蒲旭峰，閔志強，李亞麗，楊奎

自百年前出現注射用藥至今，非腸道用醫用制品中的熱原對人體的危害已經人所共知，臨床表現如下：發熱，寒顫，惡心，嘔吐，頭痛，腰及關節痛，膚色灰白，白細胞下降，血管通透性增強，嚴重者造成昏迷甚至休克，死亡。因此要求非腸道使用制品包括藥品、生物制品（包括基因工程產品和基因治療相關產品）和醫療器械裝置（體內用）都應進行熱原檢測，有效地對其熱原進行控制和檢查是臨床上安全使用的重要保證。通過使用健康人體全血分離得到的人外周血單個核細胞（PBMC）進行熱原檢測，可真實地模擬機體對熱原的反應，更好的保證了制劑的安全性。

1 熱原本質

到目前為止國內外對熱原的定義還沒有一個統一的認識[1]，一般認為熱原是指由微生物產生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。引起機體致熱反應的物質稱為熱原質[2]。熱原的本質特征是造成機體發熱。主要分為兩大類：

（1）外源性熱原:微生物來源：細菌（內毒素），病毒，蛋白，熱體蛋白等非微生物來源：抗原-抗體復合物，膽酸，本膽烷酮醇[3～4]等。

（2）內源性熱原:激素類：類固醇，前列腺素細胞因子：IL-6，IL-1β ，TNF-α 。

2 熱原發熱機理

目前關于熱原致熱的主要觀點是：幾乎所有的外源性發熱物質均通過刺激免疫細胞分泌細胞因子而最終導致機體發熱。首先是外源性熱原進入機體后刺激免疫細胞產生內源性熱原如IL-6、TNF、IL-1等細胞因子，這些因子通過終板血管器[5]直接或間接進入下丘腦視前區等中樞系統后，一方面升溫介質和神經整合作用使體溫上升，另一方面又通過內源性解熱物質作用腹中膈（VSA）和中杏仁核（MAN）等體溫負調節中樞限制體溫升高[6]。

3 目前檢測熱原的方法

3.1 家兔檢測法

家兔法檢測熱原的基本操作為：將藥品靜脈注射入家兔體內后，測其體溫升高幅度，以此來判斷熱原的有無[7]。家兔法檢測熱原能很好地反映各種熱原致熱程度，但不能定量反映熱原含量，不易標準化，并且存在種屬差異[8]，個體差異[9]較大，造成結果重復性差等。

3.2 細菌內毒素法（BET）

1956年Bang[10]發現細菌懸液與鱟血細胞溶解產物會產生凝聚，1968年，Liven和Bang[11]以此為原理，建立起鱟試驗法，即細菌內毒素法。細菌內毒素法檢測熱原的基本原理為：利用細菌內毒素可與鱟試劑特異性反應，可限量和定量檢測內毒素含量[7]。細菌內毒素檢測熱原法靈敏度高，允許半定量或全定量檢測細菌內毒素，但只能特異性地檢測細菌內毒素，并且用BET 方法檢查通過, 但卻引起了臨床熱原反應[12]，表明細菌內毒素并非唯一的致熱物質。并且鱟作為一種遠古生物，因其不合理利用瀕臨滅絕。

3.3 體外熱原檢測法

新的熱原實驗方法為Duff和Akins（1982）[13]和Dinarello（1984年）[14]提出，他們利用人外周血單核細胞產生的細胞因子進行檢測。至今多種檢測系統不斷被提出。

現在出現的新方法按細胞來源不同可分為三類：白細胞系法，人外周血單個核細胞法(PBMC法)[15～16]、人全血法[17～18]。國外對新方法的研究始于20世紀80年代，經過相關學者近30年的研究，目前已有7種方法（新鮮人全血IL-1β 、新鮮人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP1-新喋呤、THP1-TNF-α 、凍存人全血-IL-1 ）分別于2004、2005年獲得歐洲權威機構（包括歐洲替代方法論證中心，英國國家生物制品檢定所）的正式論證。

體外熱原檢測新方法的優缺點：①可以很好的反映人體對熱原的反應；②相關性好，重復性好；③檢測方法相對家兔法簡便，不需要使用動物；④操作均需在無菌條件下完成，對實驗室要求高；⑤基本為人血或動物血液，對血液來源安全性存在疑問。

4 PBMC法檢測熱原

4.1 PBMC發展概況

PBMC法是細胞法中發展得較為成熟的方法，目前已被歐洲藥典收載[19]。人外周血單個核細胞(簡寫為PBMC)不是單一細胞，它包含了人外周血中的各種免疫細胞，約12%為單核細胞，88%為淋巴細胞[20]。人血中能分泌免疫細胞因子的各主要細胞都包含其中。

人體對熱原的反應是多種免疫細胞參與作用的結果，只用一種細胞并不能完全真實地模擬機體對熱原的反應，而PBMC則克服了這個不足之處，因此該方法在可靠性上要優于其他單核／巨噬細胞法。Stephen Poole[16]，Anthony F.Suffredini[21]對該方法進行了比較詳細的研究，發現其細胞因子分泌狀況與人體發熱的真實體內細胞因子分泌狀況基本一致，該方法對細菌內毒素的檢測限可達0.015 EU﹒mL-1。2005年召開的新熱原檢測方法國際論證會議上，對PBMC法的主要論證結果如下：該方法在3個實驗室內的重復性分別為94.4% ，100% ，94.4% ；在3個實驗室的再現性分別為80.6% ，86.1% ，88.9% ；方法能夠識別熱原陽性和陰性產品的準確性分別為92.2% ，95% ，而家兔法只有57.7% ，88.3%[22]。

4.2 PBMC體外檢測熱原機理

利用從健康人體全血分離得到的人外周血單個核細胞（PBMC）模擬人體，將其與熱原標準品（如細菌內毒素）、受試藥品分別孵育，通過比較其所致內源性熱原（主要為細胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）分泌量的多少，反映藥品的致熱活性。

4.3 PBMC分離、培養

健康志愿者外周血與等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 混合稀釋后，緩慢加至淋巴細胞分離液的上方，密度梯度離心20min（2500 r﹒min-1）。小心收集位于分離液和血漿之間的單個核細胞層，并用PBS清洗2遍[23]，系統采用96孔組織培養板進行孵育，每孔加入RPMI-1640培養基100 uL、樣品或空白對照品50 uL，37 ℃，5% CO2，95%濕度條件下孵育16～24 h，吸取上清液用ELISA方法檢測細胞因子的含量[22]。

4.4 細胞因子（IL-6）檢測

單核細胞激活檢查法以人全血或外周血單個核細胞（PBMC)或單核細胞系作為檢測用細胞。一般有三種方法，包括定量測定法、半定量測定法和參考批次比較測定法。定量測定法通過標準內毒素制定標準曲線，然后從標準曲線中讀出熱原的值；半定量測定法通過與標準內毒素溶液比較得出熱原的濃度；參考批次比較測定法是供試品和經過驗證的該制品的參考批次相比較來檢測的一種方法。

目前選用的檢測指標還沒有完全趨于統一[24]。查閱文獻[25～26]表明IL-6可作為一個很好的檢測指標。并且美國食品藥品監督管理局以同意將PBMC/IL-6檢測法作為產品終熱原檢測的一個方法[25]。同時單核、巨噬細胞是重要的免疫感應和效應細胞, 單核巨噬細胞受抗原、有絲分裂原或活化因子作用后, 能轉變為活化的單核、巨噬細胞。單核、巨噬細胞的免疫功能一方面直接吞噬破壞靶細胞和靶抗原, 另一方面又能分泌多種細胞因子, 并通過細胞因子繼續產生免疫效應[27～28]PBMC包含了人血中能分泌免疫細胞因子的各主要細胞。因此可以用ELISA法檢測使用PBMC細胞培養的樣品或空白對照品。

5 結論

熱原檢測是嚴格控制各類非腸道用醫藥制品的質量，保障人民用藥安全，促進醫藥事業發展的重要手段。從最開始的家兔檢測法到研究最為深入的細菌內毒素法，本文從分析目前傳統主要用于熱原檢測的方法的優缺點，到對體外熱原檢測新方法的提出再到本文主要綜述的PBMC法。包括了PBMC的分離、培養、細胞因子的檢測。

PBMC法可以很好檢測熱原，但依然存在某些問題急需解決：①試驗中的試劑，血清等去除熱原的問題；②實驗室安全問題，使用的細胞株是否易受感染；③檢測細胞因子的試劑盒及使用的標準品因生產廠家不同和同一廠家不同批號存在差異；④血液來源的安全性，個體對熱原敏感性的差異。PBMC法作為體外熱原檢測方法之一，有很好重復性、再現性，檢測普廣，有很好的應用前景，同時滿足3R[29]即減少(reduction)、替代(replace ) 和優化(refinement )實驗動物的使用精神的體現。

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