流式細胞技術的臨床應用與分析

董興艷

流式細胞技術的臨床應用與分析

董興艷

流式細胞技術是激光為光源，集流力學技術，電子物理技術，光電測量技術，計算機技術以及細胞熒光化學技術，單克隆抗體技術為一體的新型技術儀，應用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態中的細胞或生物顆粒經行快速的，多參數的，定量分析和分選技術稱為流式細胞技術(FCM)［1］。其中生物顆粒包括大的免疫復合物，DNA，RNA，蛋白質，病毒顆粒，脂質體，細胞器，細菌，染色體，真核細胞，雜交細胞，聚集細胞等，所檢測的生物顆粒理化性質包括大小，細胞形態，胞漿顆粒化程度，DNA含量，總蛋白含量，細胞膜的完整性和酶活性學。由于融合了單克隆抗體技術，定量細胞化學和定量熒光化學，流式細胞技術作為一門生物檢測技術已經日臻完善，流式細胞或在生物學，免疫學，胞瘤學，血液學，病理性，遺傳學，臨床檢驗等學科中都得到廣泛的應用，并將為醫學科學研究發揮更大的作用。

1 生物分析原理

將懸浮分散的單細胞懸液，經特異熒光染料染色后，放入樣品管，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品在噴嘴附近組成一個圓柱流束自噴嘴的圓形孔噴出，于水平方向的激光束垂直相交，相交點成為測量區。染色的細胞經激光照射后發出熒光，同時產生光散射。這些信號分別被呈90℃角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和向前角放置的光電二級管散射光檢測器接收，經轉換器轉換或電子信號后，經模/數轉換輸入計算機，計算機通過相應的軟件儲存，計算，分析這些數字化信息，就可得到細胞的大小活性，核酸含量，酶和抗原的性質學物理和生化指標。

2 細胞分選原理

在壓電晶體上加上頻率為30kH2的信號，使之產生同頻率的機械振動，流動室也就隨之振動，于是通過測量區的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。由于各類細胞的特性信息在細胞形成或液滴以前在測量區已被測定，并儲存在計算機中，因此當某類細胞特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴充以標定的電荷，而不符合分選條件含細胞懸液滴及不含細胞的空白液滴不被充以特定電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉和向右偏轉。落入指定的搜集器內，不帶電的液滴不發生偏轉，垂直落入廢液槽中被排出，從而達到細胞分類，收集的目的。

3 主要性能指標

熒光測量的靈敏度:流式細胞技術均可檢測到＜600個熒光分子指標。一般是以檢測到單個微球上最少存有FTTC或0E熒光數目來顯示。

分辨率:分辨率是衡量儀器測量精度的指標，通常用變異系數CV表示，流式細胞儀最佳狀態CV＜2%。

流式細胞儀的分選速度為:3000個/s～6000個/s。大型儀器可達每秒幾萬個細胞。

4 流式細胞技術的臨床應用與分析

流式細胞儀是今年來發展起來的現代細胞學分析技術中的常用儀器。它具備快速，準確量，化學特性。目前已廣泛應用于免疫學，細胞生物學，血液學，腫瘤學，病理學，遺傳學，臨床經驗學多領域。

4.1 FCM在免疫學中的應用 流式細胞術是在細胞分析和分選的基礎上發展起來的一種新的細胞參數計量技術。它以其快速靈活和定量的特點，廣泛應用于免疫學理論研究和臨床實踐:有現代免疫技術基石之一之稱。尤其同單克隆抗體的結合應用，在淋巴細胞及其亞群分析，淋巴細胞功能分析，免疫分型，分選，腫瘤細胞的免疫檢測，機體免疫狀態的監測，免疫細胞系統發生及特性研究等方面都起著相對重要作用。

4.2 在血液學中的應用 血液病多為腫瘤性，免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占總數的一半以上，流式細胞儀(FCM)在血液病及淋巴瘤的發病機制，診斷治療和預后判斷學方面都具有重要價值。

白血病患者的異常細胞在分化過程中受外因，內因或突變等因素的影響曾克隆性異常增殖。白血病的免疫分型是選擇化療方案和判斷預后的重要依據。FCM結合單克隆抗體的應用對白血病經行免疫分型。可以提高白血病分型診斷的符合率。可為指導治療和判斷預防提供幫助。

4.3 流式細胞技術在細胞生物學中的應用 流式細胞技術在細胞生物領域內的應用，是流式細胞儀在基礎研究中應用范圍最廣的領域。目前細胞生物學研究中，應用最頻繁也是最普通的是細胞周期分析，包括細胞周期個時期的百分比和細胞周期動力學參數的測定內容。在方法學上除一般的化學染色方法外還有抗溴脫氧脲嘧啶核苷單克隆抗體技術，對同一細胞的參數測定技術則導致了對細胞周期的一些新發現，典型的方法是吖啶橙雙染技術，這個技術不僅可以進行細胞周期分析，而且給細胞周期的研究帶來了一些新的概念。流式細胞測量術和分選術在染色體，精子，和精細胞的研究及遺傳學，分子遺傳學也都有用武之地。

4.4 流式細胞術在腫瘤學中的應用 流式細胞儀在腫瘤學研究方面已成為重要手段之一。近年來引起腫瘤研究者的極大關注。對于制定近年來熒光細胞化學技術的發展以及熒光探針標記單克隆抗體為流式細胞技術研究各種腫瘤抗原，腫瘤蛋白，致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤研究水平，并為流式細胞技術在腫瘤學研究中開辟了更廣闊的應用前景。

4.5 流式細胞技術在AIDS病檢測在的分析 流式細胞術用AIDS病免疫功能的檢測的重要手段，采用參數熒光標記計數可對T淋巴細胞及亞群經行分析并通過動態監測T細胞亞群可以對HIV感染者或AIDS發病都進行區別。僅為HIV攜帶者，病毒未復制時，其Th細胞下降不明顯。當發展為AIDS時Th細胞水平明顯下降，如Th1細胞＜Th2細胞時，HIV在細胞間的傳播和感染更敏感，易發生AIDS。同時，當HIV陽性而無癥狀的患者，其 Tc對 Tc激活劑不反應者，其體內CD+4Th細胞水平下降迅速。條件致病微生物感染率也同時增加，對Tc激活劑反應敏感者，可維持CD+4Th細胞水平降低較慢或不降低，減少發生AIDS的幾率。

4.6 流式細胞儀對自身免疫性疾病相關HLA抗原的分析

有些疾病的發病常與一些類型的HLA抗原檢出有關，在這些疾病中，某些HLA抗原檢出率比正常人群檢出率高，最典型疾病是強直性脊柱炎，其外用HLA-B27表達及表達程度與疾病的發生有很高的相關性，利用FCM可以進行HLA-B27/HLA-B7雙標記抗體檢測HLA-B27陽性細胞，同時又排除交叉反應。通58%～97%的強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅為2%～7%檢出這種抗原。FCM檢測HLAB27快速，特異，敏感，為強直性脊柱炎的臨床診斷提供了有力幫助。

總之，流式細胞技術在血液學，腫瘤，細胞生物學和自身免疫性疾病臨床診斷治療中具有廣泛的應用價值。

［1］ 王蘭蘭，吳健民.臨床免疫學與檢驗.人民衛生出版社出版，2004．

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