槲皮素通過抑制己糖激酶的表達促進結腸癌SW480細胞凋亡

盧創新 崔瑤 李曉燕 周云

己糖激酶(Hexokinase，H K-Ⅱ)是腫瘤組織中糖酵解的限速酶，它在腫瘤組織中表達的量及活性的增加，使得腫瘤組織在乏氧的情況下為瘤細胞本身的生長和增生提供必需的能量［1］。槲皮素具有廣譜的抗腫瘤作用，但其促腫瘤細胞凋亡機制尚未完全明確。本研究旨在對槲皮素促進結腸癌SW480細胞的凋亡機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌SW480細胞株由本實驗室保存。RPM I-1640培養液，美國Hyclone;胎牛血清購自Gibico公司，噻唑藍(MTT)、Annixin-v、PI購自 Sigma公司;槲皮素購于哈藥集團制藥六廠;羊抗HK-Ⅱ多克隆抗體購自santa cluz，S-P試劑盒購于北京中杉金橋。

1.2 細胞培養與藥物處理 采用人結腸癌SW480細胞系，于37℃、5%CO2飽和溫度培養箱中培養。細胞貼壁生長，每2～3 d傳代一次。槲皮素在培養中的終濃度分別為12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L。空白對照組不加藥，以等量培養液代替。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 將對數生長的人結腸癌細胞，2 ml/孔接種于6孔板，分別加入槲皮素組和對照組各處理組試劑，繼續培養24 h，收集各處理組細胞，用PBS洗滌細胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5 μL AnnexinV/FITC和P I 10 μL，旋渦混勻，室溫避光染色15 min，進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.4 細胞免疫化學 常規制作細胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定。按免疫組化SP法步驟進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。己糖激酶主要在胞漿表達，呈棕黃色，空白對照呈陰性。200倍鏡下隨機取5個視野，計算每個視野陽性細胞數，陽性反應者用德國LeicaQ550 cw圖像分析系統在統一光強，統一放大倍數(200)下測量表達情況，以染色最淡的視野為起點，隨機選取視野測定其灰度值作為陽性表達的量化指標，并進行統計學分析。

2 結果

2.1 不同藥物組對SW480細胞凋亡的影響 選擇槲皮素的5個濃度組進行實驗，各組藥物分別作用SW480細胞48 h，發現各濃度組槲皮素誘導SW480細胞凋亡能力均高于空白對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，并隨濃度升高而逐漸升高(P＜0.05)。

2.2 槲皮素作用前后SW480細胞中己糖激酶蛋白表達的比較 正常己糖激酶蛋白主要在胞漿表達，呈棕黃色均勻染色為陽性表達。對己糖激酶表達陽性的樣本行圖像分析，測其灰度值作為其表達強度的量化指標。灰度值與實際表達強度成反比。己糖激酶在槲皮素作用48 h后，隨槲皮素濃度升高而表達強度逐漸下降，與空白對照相比均具有統計學差異(P＜0.05)。

3 討論

惡性腫瘤細胞中糖酵解活躍，依靠糖酵解獲取能量是其主要的能量獲取方式［2］。高糖酵解與線粒體結合型HKI、HKII高表達相關。實驗證實在四種HK的同工酶中，HKⅡ與腫瘤相關性最大。腫瘤細胞中高水平線粒體結合型HKII能抑制腫瘤細胞凋亡，從而繼續生長增殖。腫瘤特征性的糖代謝酶類，就像腫瘤中其他的調節因子一樣，也引起了人們的關注。從一定程度地抑制或影響這類調節因子，可以影響腫瘤的能量代謝，而正常細胞不受影響。因此，針對HK-Ⅱ的治療可能為治療高葡萄糖代謝腫瘤提供一個新的策略。通過RNA干擾技術沉寂基因表達來抑制HK-Ⅱ的合成，其可行性及有效性已獲得實驗證實。

從既往實驗室研究來看，槲皮素都顯示出一定的抗癌效果，多通過提升自身免疫力來發揮治療作用［1，2］，對正常組織的損失很小。若能證實其具有直接的抗腫瘤作用，將有較大意義，可為結腸癌等實體瘤的治療提供有益的方法和實驗依據。在本實驗中研究發現，槲皮素具有誘導結腸癌SW480細胞的凋亡的能力，并隨濃度升高而增強，在此過程，己糖激酶的表達水平受到影響，并隨槲皮素的濃度升高而表達下降，可以推測，正是槲皮素抑制了己糖激酶的表達，使得腫瘤細胞的糖酵解正常程序陷入紊亂，進而誘發了凋亡信號通路，促進其凋亡。但是，槲皮素抑制結腸癌SW480細胞中己糖激酶表達的機制，尚需進一步的實驗研究。

［1］吳平安，李國華.HK-Ⅱ與腫瘤關系的研究進展.實用臨床醫學，2009，10:133-134.

［2］Wilson J E.Hexokiunses.Bey Physiol Biochem Pharmacol，1995，126:65-198.

［3］張軍暉，邢念增，康寧，等.槲皮素對TRAMP-C2前列腺癌細胞的抑制作用.中華實驗外科雜志，2006，23(10):1240-1241.