聚合物分離介質在多肽分離中的應用

姜 和，付訓忠，閔文杰

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶前沿生物技術有限公司，重慶 400041)

多肽類藥物的研究與開發是我國21世紀生物醫藥研究的重點方向之一。許多多肽對人的生理與病理過程，疾病的發生、發展及治療有著重要意義，在臨床上具有巨大的應用價值。然而在多肽類藥物的研究與開發中，往往因在下游的分離與純化過程中所存在的技術瓶頸，導致難以獲得令人滿意的目標多肽或制備規模。近年來一類新型的聚合物分離介質因其良好的分離效果、穩定的物理化學性質及高吸附載量，在多肽類藥物的分離與純化中得到越來越廣泛的應用，也為多肽的分離介質選擇提供了新的途徑。

目前，在多肽分離純化中最常用的分離介質是以硅膠為基質的反相填料(如 C4、C8、C18等)，然而以C18為代表的反相硅膠填料存在穩定性差、pH值使用范圍窄(pH值為2～8)、易污染、難以清洗和再生等缺點，同時在反相體系中多肽會帶有電荷，易被硅膠表面所帶的硅醇基吸附，導致出現峰型展寬、拖尾等不利影響［1－2］。此外，一些堿性多肽在酸性條件下不能被分離，而只有在堿性條件下才能夠被分離。為了克服反相硅膠分離介質固有的缺陷，學者們把注意力轉向了一類新型的聚合物分離介質。此類分離介質的pH值使用范圍大(pH值為1～14)，在強酸及強堿溶液體系中化學穩定性和粒徑均一性好。其中在多肽分離中應用最多的反相聚合物分離介質表面無極性，不含鍵合的烷基官能團和殘留的硅醇基，不易產生不可逆的吸附作用，并且能有效保持生物樣品的活性，可代替反相硅膠應用于多肽類物質的分離純化［3－4］。此外這些分離介質還能抵御極端條件下的在線清洗。在高pH值條件下的反相分離能夠使分離度增加，并且提高堿性樣品的溶解度［5－11］。

1 聚合物分離介質的發展、分類與性能

自20世紀60年代以來，聚合物作為色譜介質已被用于生物大分子的分離［12］。但受限于聚合技術等因素，早期的聚合物剛性較差，只能在低壓、低流速下使用，不能用于高效液相色譜分析，且分離能力不佳，難以應用于藥物的精細分離。化學鍵合相硅膠介質(如常用的C18介質)很好地彌補了聚合物介質剛性不足、分離能力有限等缺點，成為廣泛應用于多肽的反相高效液相色譜分離介質［13－15］，但此類介質化學穩定性差，在強酸或堿性環境中長期使用會造成鍵合相脫落或基質溶解，嚴重影響色譜柱的分離效果和使用壽命。與使用范圍限于pH值為2～8的硅膠類介質相比，聚合物分離介質不僅能耐受低pH值溶液，還能用NaOH溶液清洗和再生，更適用于多肽等生物分子在反相色譜中的分離，因此，近年來具有高機械強度、優異分離性能及良好化學穩定性的聚合物分離介質又重新引起了科研工作者的關注。

按照聚合基體的不同，聚合物可以分為聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分別是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為聚合單體，加入致孔劑聚合而成。早期的聚合物分離介質因孔徑較大，稱為大孔吸附樹脂，其性質介于天然吸附劑(活性炭、硅膠和硅藻土)和離子交換劑之間，其吸附特性與天然吸附劑類似，比離子交換劑更容易再生，是吸附性和分子篩性原理相結合的分離介質［16］。根據其結構表面帶或不帶有不同極性的功能基，可分為非極性、中極性和極性3類［17］。目前大孔吸附樹脂已廣泛應用于中藥提取液及多肽的分離純化。但因大孔吸附樹脂本身粒徑較大等因素導致其分離能力較低，在物質的精細分離純化中很難達到所需的純化要求及質量標準。近年來隨著聚合技術的發展，新型的精細聚合物分離介質隨之誕生。精細聚合物分離介質一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為單體聚合而成，其粒徑分布為數微米至數十微米，比表面積達到600 m2/g，具有更好的粒徑分布、更小的平均粒徑和更高的比表面積，因此擁有更好的分離度和更高的吸附載量，加上其優異的化學穩定性，在多肽等生物分子的反相分離純化中的應用也越來越廣泛，且制備規模也越來越大。

合成聚合物介質的方法有種子聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法和乳液聚合法等［18］。根據欲分離的蛋白多肽特性，可以在聚合物的基礎上鍵合所需基團制成相應的分離介質(如離子交換層析介質)。在分離制備柱的類型上，也可以將制備柱制成顆粒預裝柱或單體柱。其中單體柱是將聚合單體原地裝入所需柱體內，再加入交聯劑與致孔劑制成結構上的單體柱。相對于傳統的顆粒預裝柱，單體柱的使用不常見，但因其具有相對簡單的聚合技術、良好的流體動力學特性及較小的傳質阻抗，使其在多肽微量規模的分離純化中的應用較多。

2 聚合物分離介質的應用

2.1 大孔吸附樹脂的應用

大孔吸附樹脂是20世紀60年代發展起來的一類最早應用于物質分離的有機高分子聚合物吸附劑，因其良好的選擇性吸附性能，使其早期被廣泛應用于工業脫色、環境保護、天然植物中活性成分提取等領域［13］。近年來，隨著生物技術的發展，使得大孔吸附樹脂在生物活性物質生產上的應用逐漸增多。該樹脂的優點在于在提取酶、氨基酸、蛋白質、肽等時的條件溫和，設備簡單，操作方便，可避免有機溶劑帶來的環保、成本昂貴等問題，還可以避免由于加熱、化學處理過程而造成生物活性降低。徐世芳等［19］在酪蛋白非磷肽的分離過程中，篩選了12種大孔吸附樹脂，發現其中DA201－C大孔吸附樹脂可以非常好地吸附酪蛋白非磷肽，去除其中的無機鹽，酪蛋白非磷肽的回收率可達到95%。唐成康等［20］采用D101大孔吸附樹脂，從山茱萸干果中提取到粗提物，再經SP Sepharose和Sephacryl S－300柱層析，得到一種具有抑制α－淀粉酶活性的糖蛋白(CoGP)。但隨著藥品質量標準的提高，以及蛋白多肽類藥物自身特殊性，使得大孔吸附樹脂在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應用受到了極大的限制。蛋白多肽類藥物的給藥途徑一般為注射給藥，其對藥品本身的安全性要求很高，而一般的大孔吸附樹脂在聚合過程中加入的聚合單體與致孔劑會產生許多有毒的有機殘留物，如苯、苯乙烯和二乙烯苯等，即使在后期的樹脂預處理過程中也很難將這些有機殘留物完全除掉。而這類殘留物大部分屬于一類有毒有機溶劑，因此極大地限制了其在蛋白多肽類，以及通過注射給藥的藥物分離純化上的應用。但近年來國外科研工作者通過改進聚合技術研發出吸附力強、殘留低的聚合樹脂，如Rohm－Hass(羅門哈斯)生產的XAD系列、Organo(三菱化學)生產的HP系列等。這些吸附樹脂在有機殘留物的控制中能夠達到很高的質量標準。其中Rohm－Hass的XAD16系列樹脂還通過了美國FDA認證，使得其能夠安全地應用于蛋白多肽類藥物的分離純化，也為大孔吸附樹脂應用于注射給藥類藥物的分離純化開創了先例。

2.2 精細聚合物分離樹脂的應用

雖然有機殘留低的大孔吸附樹脂的出現，使得其在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應用有了安全性的保障，但大孔吸附樹脂的大孔徑致使其分離能力受到限制，難以達到所需的分離能力，更難以應用于蛋白多肽類藥物的精細分離。直到20世紀90年代，包括Rohm－Hass的CG與XT系列及Organo的CHP系列等在內的精細分離樹脂的開發成功，才使得上述局面得以打破。此類精細分離樹脂的優點在于粒徑更小(分析型的平均粒徑可以達到4 ～10 μm，制備型為20 ～100 μm)，比表面積大，均一系數高，剛性強度高，再結合聚合物本身的化學穩定性高，pH值適用范圍廣，吸附載量高等諸多優勢，使得該類樹脂近年來在植物有效成分、多肽、生長因子、酶、蛋白質等大分子物質的分離純化中的應用越來越普遍，也取得了很好的分離效果，且可以放大至制備規模［21－23］。Jamil Mohammad 等［24］使用粒徑 5 μm 的聚乙烯苯 － 二乙烯基苯聚合物預裝柱(150 mm ×4.6 mm I.D)，在pH值為2～12的溶液中對血管緊張素肽混合物進行了分離條件研究的實驗。實驗結果表明，在以乙腈為洗脫液的反相分離條件和pH值為12(10mM/NaOH)的條件下多肽混合物得到了很好的分離，且分離度高于其他酸性溶液。Michiel H.M等［25］利用聚苯乙烯苯－二乙烯基苯聚合單體柱，在LC/MS模式下對其應用于蛋白降解物分析的可能性進行了研究。使用不同柱長的制備柱對含有9種蛋白混合物的蛋白降解物進行分離，發現隨著柱長的增加，其峰容量明顯增加。Quanzhou Luo 等［26］使用 10 μm 粒徑的聚乙烯苯－二乙烯基苯聚合物制成的多孔開管式開放柱與強離子交換柱和質譜串聯形成在線三維俘獲柱，應用于蛋白質組學的超痕量物質研究。研究表明，在使用上述三維俘獲柱對一種宮頸癌細胞株差異凝膠胰蛋白酶的降解物進行分離與分析時，最終包括癌癥相關蛋白(如MAP激酶)的5047種多肽的1857種獨立蛋白被識別與鑒定。

相對于聚苯乙烯型分離介質，甲基丙烯酸型分離樹脂的研究起步較早，且多以聚合成的單體柱應用于物質的分離。從反相分離性能上比較來看，甲基丙烯酸型反相分離樹脂的疏水性要低于聚苯乙烯型反相分離樹脂，其在植物有效成分、酶及蛋白多肽的分離純化上也有很好的應用。Lee等［27］使用甲基丙烯酸聚合而成的單體毛細管柱對核糖核酸酶A、細胞色素C、肌紅蛋白、卵清蛋白混合物進行分離，在優化了的梯度洗脫條件下混合物得到了很好的分離。

我國在聚合物分離樹脂上的研究相對于國外起步較晚，但近年來也相繼開發出國產的聚合物分離樹脂，并成功應用于包括蛋白多肽類在內的各種生物大分子的分離純化。邵承偉等［28］采用聚苯乙烯－二乙烯基苯(PS－DVB)型麥科菲反相高效液相色譜柱 (MKF－RP－MH)對胸腺素 α1(Tα1)進行分離，采用乙腈為洗脫液進行反相梯度洗脫，在優化色譜條件(流動相A:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0或8.0;流動相B:乙腈，梯度洗脫條件 0～20 min，0～10%乙腈，20～30 min，10% ～30% 乙腈;溫度:30℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:214 nm)下分離了胸腺素α1標準品和樣品。樣品濃度在0.05～4.00 g/L時，線性方程為 C=0.0099A －0.078，r=0.9904，胸腺肽α1最大載量為6 g/L。實驗結果表明:聚合物型MKF－RP－MH反相色譜柱可以代替傳統的C18硅膠柱，很好地應用于Tα1的分離純化。

3 反相聚合物型分離介質與反相硅膠(C18)在蛋白多肽分離純化應用上的比較

3.1 應用于分離純化所存在的優勢

1)化學穩定性高。目前傳統的C18反相硅膠填料是以硅膠為基體，鍵合上疏水基團，其pH值適用范圍基本在2～8，pH值偏高或者偏低都會對填料本身產生損傷。特別是當pH偏高時硅膠基體會發生明顯的溶解。而反相聚合物分離介質是以聚合單體為基體，加入交聯劑聚合而成，沒有鍵合相，在pH值為1～14的條件下都具有良好的化學穩定性。因此對于那些在堿性條件下具有良好分離效果的蛋白多肽混合物，反相聚合物分離樹脂具有明顯的穩定性優勢。

2)吸附載量高。對于制備規模的混合物的分離純化，分離介質的吸附載量的高低在很大程度上決定著分離純化的效率與成本。相對于C18反相硅膠，反相聚合物分離介質在吸附能力上具有明顯的優勢。如在使用Rohm－Hass的CG系列反相樹脂對牛血清蛋白進行分離實驗時發現［29］:其有效分離載量基本達到30 mg/mL，且隨著載樣流速的增加，其有效分離吸附載量沒有明顯的變化;而 C18反相硅膠的有效分離吸附載量為10 mg/mL，當載量繼續增大時其分離效果明顯降低。

3)與C18在多肽的分離上具有很好的互補性。精細聚合物反相分離樹脂的出現使得聚合物分離填料應用于蛋白多肽的分離純化成為現實。對于C18反相硅膠填料較難分離的復雜多肽混合物，精細樹脂可能具有更好的選擇性。王靜等［15］以二乙烯基苯為原料，采用微孔膜乳化－懸浮聚合法制備了粒徑為25 μm的聚二乙烯基苯(PDVB)微球，考察了PDVB介質的物理性能及其作為半制備級反相高效色譜填料的分離性能和應用潛力，并且對PDVB微球在多肽分離上的性能進行了實驗研究。實驗以催產素、血管緊張素Ⅱ、血管緊張素Ⅰ和胰島素的混合溶液為樣品，在以TFA作為離子對試劑的條件下反相梯度洗脫分離，并且與相同粒徑的商品化的C18球形介質進行了對比。實驗結果表明:PDVB半制備柱對4種多肽的混合物能完全分離，各相鄰兩色譜峰的分離度均大于1.5，各峰的拖尾因子均在 1.00 ～1.35，峰形較對稱，理論塔板數最高可達21000 m－1;而C18介質分離譜圖峰形較寬，分離度及理論塔板數均不及PDVB介質，尤其是對于血管緊張素II和血管緊張素I，二者之間僅相差2個氨基酸殘基，用C18介質難以將二者很好分離。PDVB介質實現了對二者的完全分離，說明在血管緊張素等多肽藥物的分離純化領域，PDVB介質有著很好的分離效果。

4)填料易于裝填與再生。作為中低壓分離介質，反相聚合物分離樹脂更易于裝填，而不需要像C18反相硅膠裝填時所需的高壓和特殊裝填設備，更利于實驗室研究制備規模的擴大和工業化生產。

3.2 應用于分離純化所存在的缺陷

雖然隨著聚合技術的發展，聚合物分離介質的剛性有了很大的改善，其耐壓能力也相應有了很大的提高，但相對于包括C18在內的反相硅膠填料，其最大耐壓能力仍低很多，因此也導致在裝填時所允許的最大裝填壓力低很多，最終導致分離能力的下降。即使在相同粒徑的情況下，聚合物分離介質也往往難以達到與反相硅膠相同的分離能力水平。

4 結束語

進入21世紀以來，生物醫藥技術得到了突飛猛進的發展，各種具有治療作用的蛋白多肽類物質被發現，因此分離純化這項下游技術在推動其產業化過程中顯得尤為重要。聚合物分離介質的出現無疑為蛋白多肽類物質分離純化介質的選擇提供了一條新途徑。聚合物分離介質自身所特有的高化學穩定性、高吸附載量彌補了傳統反相硅膠填料的許多不足。近年來的研究與應用表明:聚合物分離介質在蛋白多肽類物質分離純化中具有廣泛的應用前景，并日益顯示出其獨特的作用與優勢。相信隨著研究的深入，不斷涌現的各種性能更加優良的聚合物分離介質必將和其他各種分離介質一起推動著蛋白多肽類藥物的研發，為生物醫藥技術的進步作出貢獻。

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