芽孢桿菌在石蠟油降解過程中的形態變化

余 瑛，衛澤峰，郭志龍，黃偉九，陳波水

(1.重慶理工大學 a.藥學與生物工程學院;b.材料科學與工程學院，重慶 400054;2.后勤工程學院軍事油料應用工程系，重慶 401311)

石蠟油是石油制品之一，性能穩定，很難降解。1971年Felix和Cooney［1］就曾經報道能形成芽孢的細菌在石油降解中具有重要作用，但迄今為止人們對微生物降解石油的詳細機制仍不完全清楚。芽孢桿菌具有在營養充足時以營養體形態存在，營養貧乏時形成芽孢的特性［2－5］。芽孢桿菌以營養體呈現，則表明其生長旺盛，代謝活躍;若進入芽孢形成期則表明其進入休眠狀態，代謝活性降低，甚至停滯［6－7］。芽孢桿菌由營養體到芽孢形態的轉變是對環境變化所產生的應答，該應答導致芽孢桿菌內基因表達類型發生改變，進而產生表型變化［8］。因此通過芽孢桿菌的形態變化可以間接了解其對石蠟油的降解情況，為進一步明確微生物降解石油制品的機理和利用生物降解法進行環境污染治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

芽孢桿菌由重慶理工大學藥學與生物工程學院實驗室篩選、保存。

1.1.2 試劑

1)培養基

無機鹽培養基:NaNO30.1 g/L;KH2PO40.1 g/L;CaCl20.03 g/L;NH4NO30.15 g/L;MgSO40.1 g/L;(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，痕量;pH 值為7.0～7.2。

模擬石蠟油污染廢水:NaNO30.1 g/L;KH2PO40.1 g/L;CaCl20.03 g/L;NH4NO30.15 g/L;MgSO40.1 g/L;(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，痕量;石蠟油2 g/L;pH值為7.0～7.2。

富集培養基:牛肉膏 5 g/L;蛋白胨10g/L;NaCl 5 g/L;pH值為7.0～7.2;若制備固體培養基，則另外加入瓊脂15 g/L。

2)芽孢染色試劑

7.6%的孔雀綠石飽和水溶液;0.5%的番紅溶液。

1.2 方法

1.2.1 石蠟油降解過程中芽孢桿菌的生長情況

從分離培養基平板上分別挑取各細菌的單菌落接種于富集培養基中，30℃，200 r/min培養24 h，然后離心收集菌體。采用用無機鹽培養基(菌體質量比重為9∶1的懸菌體)，將該菌懸液1 mL接種到100 mL的模擬石蠟油污染廢水中，30℃，200 r/min培養。每隔 1 d取菌液測定OD600值。

1.2.2 石蠟油降解過程中菌體形態變化

首先取試驗用芽孢桿菌接種于富集培養基中，30℃，200 r/min培養24 h，然后離心收集菌體。用無機鹽培養基重懸菌體，接種到100 mL模擬石蠟油污染廢水中(菌群數約為107cfu/mL)，30 ℃，200 r/min 培養，分別于 0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 d取樣，用Schaeffer-Fulton氏染色法進行制片。制作過程簡要敘述如下:用接種環從培養瓶中取2～3環，按常規方法將待檢菌制成涂片;待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2～3次;加7.6% 孔雀綠水溶液于涂片處，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽，持續15～20 min;待玻片冷卻后 ，用水輕輕沖洗至流出的水無色，用0.5%蕃紅液染色5 min;水洗、晾干。于顯微鏡下觀察菌體形態，發現芽孢呈綠色，菌體為紅色。統計不同培養時間各制片中芽孢及菌體的比例，每個時期制片3張，每張制片統計100個芽孢及菌體。

2 試驗結果

2.1 石蠟油降解過程中芽孢桿菌的生長情況

供試芽孢桿菌從富集培養基轉入到模擬石蠟油污染廢水中以后，3 d內有一生長遲滯期，4～8 d是其快速生長期，之后為衰退期(見圖1)。遲滯期的存在表明芽孢桿菌對石蠟油的代謝途徑所涉及的基因表達模式屬于誘導型表達。芽孢桿菌從營養豐富的富集培養基中轉入以石蠟油為唯一C源的模擬石蠟油污染廢水中需要重新適應新的環境，啟動與石蠟油代謝相關的基因表達，這樣才能利用石蠟油進行生長。芽孢桿菌以石蠟油為唯一C源時其快速生長期的生長速度也較為緩慢，表明石蠟油是一種芽孢桿菌較難降解的C源。這與微生物對石油制品的利用率較低［9］的報道一致。

圖1 芽孢桿菌在模擬石蠟油污染廢水中的生長情況

2.2 石蠟油降解過程中菌體形態變化情況

在以石蠟油為唯一C源的模擬污染廢水中，培養芽孢桿菌，間隔0.5或1 d取樣制片，進行芽孢染色和顯微觀察。結果發現0.5 d開始有芽孢形成，3 d后營養體幾乎完全轉化為芽孢，5 d后芽孢又開始重新萌發形成營養體(見圖2)。該結果表明，由于芽孢桿菌只有以營養體形態存在時才能利用石蠟油，因此芽孢桿菌分解石蠟油的速度較慢。因為石蠟油降解速度慢造成可直接利用的C源不足，因此0.5 d后芽孢才形成。后期芽孢重新萌發則表明與石蠟油利用相關的基因表達量增加或部分石蠟油降解成小片段后可利用度提高，C源不足的情況開始緩解。

圖2 石蠟油降解過程中芽孢桿菌的形態及孢子形成率

3 討論

芽孢桿菌能在以石蠟油為唯一碳源的培養基中生長，表明它能利用和降解石蠟油，但其生長速度較慢，并且要經歷“營養體→芽孢→芽孢重新萌發形成營養體”的過程。盡管石蠟油的組分以直鏈烷烴為主，但仍然比較復雜。微生物降解石蠟油的過程可能涉及到多種基因的共同參與，從芽孢桿菌利用石蠟油時存在生長遲滯期和對芽孢桿菌生長形態的變化可以推測，芽孢桿菌中與石蠟油代謝相關的主要基因的表達屬于誘導型，因此啟動石蠟油降解需要較長的時間，最終導致芽孢桿菌在石蠟油中生長緩慢。

微生物對石油制品中各類不同組分的生物降解的難易程度與組分的結構相關，降解由易到難依次為:直鏈烷烴(n-alkanes)＞單環烷烴(monocyclic alkanes)＞烷基苯(alkyl benzenes)＞異戊二烯(isoprenoids alkanes)＞萘(alkyl naphthalenes)＞雙環烷烴(bicyclic alkanes)＞甾(steranes)＞藿烷(hopanes)［10］。此外，環境因素如離子濃度、溫度、pH值等也影響微生物對石油制品的降解［11］。因此，芽孢桿菌或其他微生物在對擁有更復雜結構的石油制品的降解過程中的生長情況和形態特點仍待進一步研究。

［1］Felix J A，Cooney J J.Response of spores and vegetative cells of Bacillus spp.in a hydrocarbon-water system［J］.J Appl Bacteriol，1971，34:411 －416.

［2］萬俊杰，梁耀開，鄧毛程.食品廢水培養枯草芽孢桿菌產絮凝劑及固定化吸附Cu2+研究［J］.安徽農業科學，2011(14):8600 －8603，8686.

［3］姚小飛，葉璐，趙世敏.枯草芽孢桿菌的選育及其發酵豆粕的工藝條件研究［J］.安徽農業科學，2010(16):8476－8478.

［4］楊宇清，鄭一敏，胡楊，等.枯草芽孢桿菌3－2產細菌素發酵條件的優化［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2011(11):39 －43.

［5］陳沖，佟建明，張潞生.地衣芽孢桿菌16S－ITS標記及其特異性分析［J］.安徽農業科學，2011(14):8206－8207.

［6］Cunha C D，Rosado A S，Sebastián G V，et al.Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，73:949－959.

［7］Leuschner R G K，Ferdinando D P，Lillford P J.Structural analysis of spores of Bacillus subtilis during germination and outgrowth［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2000，19:31 －41.

［8］Stragier P，Bonamy C，Karmazyn-Campelli C.Processing of a sporulation sigma factor in Bacillus subtilis:How morphological structure could control gene expression［J］.Cell，1988，52:697 －704.

［9］Das K，Mukherjee A K.Crude petroleum-oil biodegradation eYciency of Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contaminated soil from North-East India［J］.Bioresource Technology，2007，98:1339 －1345.

［10］Sun Y，Chen Z，Xu S，et al.Stable carbon and hydrogen isotopic fraction of individual nalkanes accompanying biodegradation:evidence from group of progressively biodegraded oils［J］.Org Geochem，2005，36:225 －238.

［11］McKew B A，Coulon F，Michail M，et al.Efficacy of intervention strategies for bioremediation of crude oil in marine systems and effects on indigenous hydrocarbonoclastic bacteria［J］.Environmental Microbiology，2007，9:1562－1571.