基質金屬蛋白酶－2組織抑制劑基因多態性與蛋白質表達的關系

王 偉，徐 敏

(1.咸寧學院臨床醫學院內科學教研室，湖北咸寧437100;2.湖北省鄂鋼醫院)

蛋白酶/抗蛋白酶失衡假說已成為公認的與肺疾病(如慢性阻塞性肺病、肺纖維化等)發病有關的機制之一［1］。有研究顯示［2］，TIMP－2 基因 +853位點多態性與慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的易感性有關，特別是當吸煙者存在等位基因G時易患COPD。本研究通過分析肺組織中TIMP－2基因多態性的改變與蛋白質表達的關系，進一步探討TIMP－2基因多態性的改變在COPD發病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象

選擇肺大泡、肺癌手術切除的無病變肺組織29份，其中肺大泡7例、肺癌22例，標本立即置于－70℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 組織基因組DNA提取

取凍存的肺組織標本30mg，采用組織DNA提取試劑盒(美國Omega公司)提取組織基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應

引物(北京博大泰克公司合成):上游:5＇－GCCCAGGGTGTTCTGGATGG－ 3 ＇，下 游:5 ＇－CTCCGGCTGATGGCCCCACT－3＇，PCR 反應體系為 50μl，取潔凈 PCR管依次加入 10×buffer 5μl，dNTP(10mmol/L)2μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，上游引物(10mmol/L)1μl，下游引物(10mmol/L)1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)2U(Promega公司提供)，ddH2O 35.6μl，PCR 反應條件:預變性94℃ 3min;變性 94℃ 45s;退火 66℃ 45s;72℃1min;共30個循環;再72℃延伸10min。

1.2.3 酶切反應

采用內切酶BsrI(NEB公司)對+853位點PCR產物進行酶切，酶切產物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳，染色，在凝膠成像系統分析結果確定基因型。

1.2.4 TIMP－2 蛋白的檢測

免疫組化SP法檢測肺組織TIMP－2蛋白的表達:鼠抗人TIMP－2單克隆抗體，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術有限公司，標本經10%中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋，包埋組織標本作5μm連續切片，采用高溫直接煮沸法修復抗原，免疫組化SP法染色按照試劑說明書進行。用已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定

在高倍顯微鏡(10×40)下觀察細胞著色程度，進行半定量分級。TIMP－2均以實質細胞胞膜或胞質出現明顯的黃色或棕黃色顆粒判斷為陽性著色。高倍鏡下取4個不同視野，各計數200個細胞，按陽性細胞所占的百分率分為(+～+++)。無陽性細胞為陰性(－);陽性細胞＜30%為(+)，呈淺黃色;陽性細胞占30% ～50%為(++)，呈棕黃色;陽性細胞 ＞50%為(+++)，呈棕褐色。用HMIAS－2000型高清晰度彩色醫學圖文分析系統對切片染色進行定量檢測，測定肺組織陽性著色的TIMP－2蛋白積分光密度值(A值)，在相同的倍數下計算平均A值。

1.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計學軟件，頻率比較采用卡方檢驗，蛋白定量以均數±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結果

2.1 TIMP－2基因+853位點產物PCR－RFLP結果

肺組織基因型頻率分布G/G型15例(51.7%)、G/A 型 9例(31.0%)、A/A 型 5例(17.2%)。

2.2 TIMP－2 蛋白的表達

TIMP－2蛋白表達半定量分級顯示G/G型陽性率26.7%、G/A型陽性率22.2%、A/A型陽性率40%，表達無差異性(P＞0.05);TIMP－2蛋白定量檢測各型間亦無差異性(P＞0.05)，見表1。

3 討論

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類能夠水解細胞外基質的內肽酶，基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是內源性的MMPs組織特異性抑制劑，能調節MMPs活性，抑制 MMPs對細胞外基質的降解。研究表明［3，4］，與肺疾病相關的 TIMPs主要為 TIMP－1 和TIMP－2，而TIMP－2在肺組織有更強的對MMPs抑制作用，故MMPs/TIMP－2平衡有利于維持肺組織的正常形態，能阻止肺疾病的發生。

1996年，Hammani等確定人類 TIMP－2基因位于人類第17號染色體長臂17q23－17q25，全長約83kb個堿基對，含有5個外顯子和4個內含子;其基因多態性表現為－418位點和+853位點，TIMP－2蛋白是一種非糖基化蛋白，以1∶1形式與IV型膠原蛋白酶(MMP－2)結合從人類黑色素瘤細胞中分泌出來，分子量為21Ku，可以抑制MMPs家族所有成員的活性。以往研究顯示［2］，TIMP－2基因+853位點多態性表現為G/G型、G/A型、A/A型，其中G/G型與我國中部地區慢性阻塞性肺病易感性有關，多態性的改變可能影響TIMP－2蛋白。

本研究結果顯示，+853位點G/G型、G/A型、A/A型3種基因型TIMP－2蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)，說明蛋白質的表達量在3種基因型之間無差異，基因型可能與蛋白質的表達量無關。TIMP－2基因+853位點多態性與我國中部地區慢性阻塞性肺病易感性有關的機制有待進一步研究。

［1］Teramoto S，Ishii T，Yamamoto H，et al.Xenobiotic enzymes and genetics of COPD［J］.Chest，2005，127(1):408

［2］王偉，徐敏，胡克.基質金屬蛋白酶－2組織抑制劑基因多態性與慢性阻塞性肺病易感性研究［J］.實用醫學雜志，2009，25(22):3812

［3］Gualano RC，Vlahos R，Anderson GP.What is the contribution of respiratory viruses and lung proteases to airway remodelling in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Pulm Pharmacol Ther，2006，19(1):18.

［4］Segura－Valdez L，Pardo A，Gaxiola M，et al.Upregulation of gelatinases A and B，collagenases 1 and 2，and increased parenchymal cell death in COPD［J］.Chest，2000，117(3):684