酪蛋白膠束酶法修飾研究進展

楊 敏，甘伯中 ，張衛兵，梁 琪，喬海軍

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州 730070)

酪蛋白膠束酶法修飾研究進展

楊 敏1，2，甘伯中1，*，張衛兵1，梁 琪1，喬海軍2

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州 730070;2.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州 730070)

酪蛋白的穩定性與其結構密不可分。酶法修飾作為一種安全性較高的修飾技術，受到眾多研究者的關注。本文綜述了近年來國內外關于酪蛋白酶法修飾研究進展，討論了修飾酪蛋白的穩定性及功能性質，以期為乳制品加工提供參考。

酪蛋白膠束，酶法修飾，酶促交聯，水解

酪蛋白是乳中一大類蛋白質的總稱，又稱干酪素，乳中酪蛋白含量約為總蛋白的80%，主要由αs1、αs2、κ 和 β－酪蛋白組成，其質量比約為 4∶1∶4∶1［1］。κ－酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分的、對鈣不敏感的蛋白質。牛乳中這四種酪蛋白單體與磷酸鈣相互結合成直徑為 100～300nm 的膠束［2－3］。酪蛋白和酪蛋白制品有著較高的營養價值和良好的功能特性。在食品工業中，酪蛋白及其制品被廣泛用作營養補充劑。在飲料工業中，酪蛋白可以作為酸性飲料的穩定劑、酒和啤酒的澄清劑、蘋果汁的脫色劑。此外，酪蛋白及其制品還廣泛應用于肉制品、烘焙食品、人造奶油、咖啡伴侶中。在化學工業中，酪蛋白溶于堿可以得到黏性強的膠狀液。酪蛋白纖維表現出良好的吸濕性、親水性和拉絲性，適合作內衣、運動衫、兒童服裝、睡衣、床上用品等與皮膚直接接觸的織物。影響蛋白質功能特性的主要因素有:蛋白質自身，包括蛋白質的氨基酸組成、分子大小、構象等;蛋白質所處體系的性質，包括溫度、酸度等;蛋白質分子內和分子間的相互作用。隨著對蛋白質的深入研究，蛋白質修飾也作為一種有用的工具來調控蛋白質結構，提高其營養價值、感官特性和功能特性，以滿足加工業的要求。酪蛋白可以通過酰化、磷酸化、糖基化和酶法等方法對其進行結構修飾，以改變其理化性質和功能特性，從而滿足不同工業生產部門的需要。酶法修飾因其產物具有較高的安全性而成為國內外眾多學者的研究熱點。

1 酪蛋白酶促交聯修飾條件研究

蛋白質在某些酶的催化作用下，氨基酸殘基之間可以發生交聯反應，或者由于其他物質的存在，最終導致殘基之間的交聯反應。酶法修飾作用顯著，反應條件溫和，安全性高，修飾后的酪蛋白穩定性顯著增強，粘度、乳化性、溶解性、發泡性、成膜性等功能性質得以提高。

1.1 轉谷氨酰胺酶

轉谷氨酰胺酶(transglutaminase，TG)，全稱為蛋白質－谷氨酰胺－γ－谷氨酰胺基轉移酶，它可以催化蛋白質賴氨酸上的ε－氨基和谷氨酸上的γ－酰胺基結合，從而導致蛋白質分子發生共價交聯，形成相應的聚合物，改善蛋白質的溶解性、水合性等功能性質。該酶反應條件溫和，專一性強，價格低廉，是食品蛋白質修飾首選酶制劑。

轉谷氨酰胺酶在溫度為40℃，pH7.0條件下活性最高［4］。然而，Schorsch［5－6］研究表明，50℃、pH5.4 的條件下，酪蛋白膠束表面的凈電荷降低，斥力最小，為轉谷氨酰胺酶交聯酪蛋白形成凝膠的最佳條件。為了解決這一矛盾，該學者指出，先將轉谷氨酰胺酶加入到50℃酪蛋白溶液中平衡1h，再加入葡萄糖酸－δ－內酯緩慢酸化，直至凝膠形成。Smiddy［7］研究發現，轉谷氨酰胺酶在30℃下與酪蛋白反應24h后，β－或κ－酪蛋白單體已不存在，只有少量αS1－酪蛋白，說明酪蛋白膠束內交聯反應已接近完全。Jos’e［8］用綿羊乳酪蛋白替代牛乳酪蛋白進行酶法交聯研究，結果表明，綿羊乳酪蛋白在進行轉谷氨酰胺酶交聯之前，于78℃熱處理1h，交聯程度最高。

酶法交聯過程中，除了溫度、酸度等因素外，反應體系中添加其他成分對交聯反應也產生影響。Martin［9］研究發現，0.05～0.1mmol/L 谷胱甘肽可提高酪蛋白的交聯程度。研究還指出，乳清中含有轉谷氨酰胺酶的天然抑制劑。將轉谷氨酰胺酶與乳清混合而不添加酪蛋白時，酶的活性受到抑制;向該體系中加入谷胱甘肽后，酶活性得以維持。由此可見，加入谷胱甘肽或對乳樣進行預先熱處理可使乳中酶抑制劑活性降低或喪失，提高交聯程度。

國內，酪蛋白的酶法修飾也成為研究熱點。姜淑娟等［10－12］研究了酪蛋白的轉谷氨酰胺酶氨基葡萄糖修飾與功能性變化，結果表明，酪蛋白濃度3%(w/v)，37℃，pH7.5，酶添加量 10kU·kg－1，氨基葡萄糖濃度90mmol·L－1，反應4h時，交聯程度最高。由此可見，轉谷氨酰胺酶催化酪蛋白進行共價交聯修飾反應條件溫和，交聯程度高，對酪蛋白結構修飾作用顯著。

1.2 其他酶類

除了轉谷氨酰胺酶之外，其他交聯用酶制劑也受到研究者的關注。李君文、趙新淮等［13］研究指出，辣根過氧化物酶對酪蛋白進行酶促交聯的適宜條件為溫度37℃，反應時間2.9h、酶添加量為每克蛋白質4.73μkat，此條件下酪蛋白交聯度達到6.9%。交聯酪蛋白酸化凝膠的微觀結構中空穴較未交聯酪蛋白少，結構更為致密［14］。

雙孢蘑菇多酚氧化酶(PPO)對酪蛋白也具有交聯作用。當PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應4h時，交聯后的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別較未交聯的酪蛋白提高了17.3%和37.5%。這些性質的改善程度與形成的聚合物含量有著密切的關系［15］。

2 β－酪蛋白單體的酶促交聯

由于β－酪蛋白具有顯著的偶極序列，其二級結構易隨溫度改變，可自聚成膠束。因此，轉谷氨酰胺酶對β－酪蛋白的交聯作用不僅影響β－酪蛋白單體性質，還能使其在酪蛋白膠束中被“凍結”，穩定膠束結構，從而促進膠束內部酪蛋白單體間發生交聯［16］。眾多研究指出，β－酪蛋白較α－酪蛋白更易發生共價交聯，并且不同溫度交聯產物具有差異［7，17］。在35℃時，β－酪蛋白發生分子間交聯，0℃時發生分子內交聯。由于交聯修飾改變了β－酪蛋白電荷，使其物化性質發生變化，如親水性和鈣離子穩定性增加，粘度增大，其增大程度與溫度無關［18］。Monogioudi［19］比較了木霉菌酪氨酸酶和輪枝鏈霉菌轉谷氨酰胺酶對β－酪蛋白的交聯作用，發現兩種酶交聯產物分子量大小與酶用量和反應時間有關。酪氨酸酶交聯產物色澤有輕微變化，其交聯程度可通過交聯時間控制，交聯程度最高可達21，而轉谷氨酰胺酶交聯度可達71。交聯后β－酪蛋白的胃蛋白酶水解性降低，在酸性條件下的穩定性增強［20］。

3 酶促交聯修飾對酪蛋白穩定性的影響

酶促交聯使酪蛋白內部及酪蛋白之間發生共價連接，形成網狀結構，增加了維持酪蛋白結構穩定性的作用力，顯著增強了其穩定性。轉谷氨酰胺酶對酪蛋白的共價交聯發生在膠束內部，穩定了膠束，維持了酪蛋白膠束在加工過程中的完整性，限制了膠體磷酸鈣的解離和β－酪蛋白的溶解，凝膠形成時間縮短，凝膠強度、彈性模量增大，凝膠質地密集，長時間貯藏過程中不出現脫水收縮作用，可改善干酪、酸奶的加工特性［21－24］。有研究指出，交聯酪蛋白熱穩定性和高壓穩定性均顯著增強［25－26］。

酪蛋白穩定性取決于膠束粒徑，粒徑越小穩定性越高［22，25－26］。Smiddy［7］研究酪蛋白轉谷氨酰胺酶交聯條件的同時，還討論了交聯后酪蛋白的穩定性。他指出，當酪蛋白膠束內部疏水性作用完全破壞，或者膠體磷酸鈣完全解離時，酪蛋白膠束的光散射量降低95%以上，而轉谷氨酰胺酶交聯使得酪蛋白膠束穩定性增強，在其他試劑作用下的解離度降低。交聯處理24h后，加入尿素、乙醇、十二烷基磺酸鈉等試劑后，酪蛋白膠束的光散射現象仍然顯著存在，說明交聯后的酪蛋白穩定性得到顯著改善。Huppertz［27］研究表明，相比未處理酪蛋白，轉谷氨酰胺酶酶促交聯酪蛋白使位于膠束表面的κ－酪蛋白發生交聯，在乙醇作用下難以瓦解，因此交聯膠束對乙醇表現出較高穩定性。這一研究結果也被Partschefeld［28］所證實。他指出，轉谷氨酰胺酶交聯的UHT－酪蛋白膠束對乙醇(0～74vol%)、EDTA(0～0.45mmol/L)和400MPa壓力處理表現出較高穩定性。Yin［29］研究發現，轉谷酰胺酶交聯的酪蛋白與多糖水制備的凝膠穩定性顯著提高。

由于交聯修飾改變了酪蛋白結構，其功能性質也發生變化。姜淑娟，趙新淮等［10－12］研究指出，與未處理酪蛋白相比，轉谷氨酰胺酶氨基葡萄糖修飾酪蛋白的溶解性、乳化性、發泡性、粘度和粘彈性增強，表面疏水性降低，凝膠性質得到顯著改善，并且體外消化性能未受到影響。李君文、趙新淮等［14］研究指出，辣根過氧化物酶對酪蛋白進行酶促交聯后，酪蛋白乳化性和凝膠結構顯著改善。當酪蛋白質量分數為0.04%時交聯產物的乳化活性指數、乳化穩定性達到最高，分別比酪蛋白提高25.2%和7.2%。

綜上所述，轉谷氨酰胺酶對酪蛋白結構修飾作用顯著，反應條件溫和。修飾后的酪蛋白穩定性顯著增強，粘度、乳化性、溶解性、發泡性、成膜性等功能性質得以提高。由于酶法修飾不產生有害物質，安全性高，可廣泛用于乳品體系酪蛋白改性，以提高乳制品物化及感官性質，增加產品附加值。

4 酪蛋白酶法水解研究

在許多食品的加工過程中，蛋白質的水解反應是不可或缺的處理或反應。一些食品的加工工藝、產品質地改善、風味物質的形成、營養價值的提高等，均與其中的蛋白質水解直接相關。因此，酪蛋白的限制性水解備受關注。Aline［30］研究酸性土豆磷酸酯酶對酪蛋白的脫磷酸化作用時指出，該酶對α－酪蛋白和β－酪蛋白具有脫磷酸化和水解雙重作用，但對酪蛋白膠束僅表現出脫磷酸化作用。該學者采用RP－HPLC－ESI/MS鑒定了脫磷酸化后的酪蛋白，發現該酶最多可隨機除去α－酪蛋白上的8個磷酸化基團、β－酪蛋白上的5個磷酸化基團。李丹［31］利用谷氨酰胺酶對酪蛋白進行限制性脫酰胺和水解處理，以SDS－PAGE及排阻色譜分析評價產物的蛋白質降解情況。結果表明，脫酰胺酪蛋白產物對Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并隨著脫酰胺度的增加而提高。張志［32］研究指出，酪蛋白酶解產物對Zn2+的絡合能力較強，絡合產物的穩定性高，體外消化率可達100%。

酪蛋白除了具有基本的營養功能外，在其結構中還含有重要的肽類編碼，一旦通過水解技術將這些肽分子釋放出來，可以得到特定功能的生物活性肽。吳丹［33］利用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，并對所得到的水解物進行類蛋白反應修飾，制備高活性抗氧化肽。酶添加量為500U/g，溫度30℃，底物質量分數50%，反應5.6h，類蛋白反應效果較好。有關酪蛋白酶解產物抗氧化活性分析結果表明，所制備的修飾產物對DPPH、·OH、ABTS·3種自由基的清除能力顯著提高［34－37］。徐微［38］采用中性蛋白酶水解酪蛋白，一定條件下制備水解度為13.0%，IC50質量濃度為40.4mg/L的酪蛋白水解物。利用中性蛋白酶對所制備出的水解物進行plastein反應修飾。不同反應程度的修飾產物對血管緊張素I轉換酶(ACE)抑制活性分析結果顯示，中性蛋白酶催化的plastein反應修飾提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性且ACE抑制活性的提高程度與plastein反應程度有關。由此可見，酶法水解既能獲得具有生物活性的肽，又可提高食品蛋白質的功能性質，具有潛在的應用價值。

5 展望

工業的發展需要穩定性高、功能性質突出的蛋白質配料。乳制品是一個復雜的體系，其中，蛋白沉淀是影響乳制品穩定性的重要因素之一。因此，提高酪蛋白穩定性變得十分重要。酶法修飾可改變酪蛋白膠束結構，顯著提高酪蛋白穩定性。酶催化反應條件溫和，修飾產物安全性高，具有潛在的實際應用價值。但是，酶制劑價格昂貴，修飾成本高，難以實現工業化。針對該問題，有必要通過物理修飾技術輔助等方法，減少酶制劑用量，提高酶法修飾程度，以期降低修飾成本。

［1］Braga A，Menossi M，Cunha R.The effect of the glucono－［delta］－lactone/caseinate ratio on sodium caseinate gelation［J］.International Dairy Journal，2006，16(5):389－398.

［2］Martin G J O，Williams R P W，Dunstan D E.Comparison of casein micelles in raw and reconstituted［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:4543－4551.

［3］Fox P F，Brodkorb A.The casein micelle:Historical aspects，current concepts and significance［J］.International Dairy Journal，2008，18(7):677－684.

［4］Faergemand M，Qvist K B.Transglutaminase:Effect on rheological properties，microstructure and permeability of set style acid skim milk gel［J］.Food Hydrocolloids，1997，11:287－292.

［5］Schorsch C，Carrie H，Norton I T.Cross－ linking casein micelles by a microbial transglutaminase:influence of cross－links in acid－ induced gelation［J］.International Dairy Journal，2000，10:529－539.

［6］Schorsch C，Carrie H，Clark A H，et al.Cross－linking casein micelles by a microbial transglutaminase conditions for formation of transglutaminase－induced gels［J］.International Dairy Journal，2000，10:519－528.

［7］Smiddy M A，Martin J E，Kelly A L，et al.Stability of casein micelles cross－ linked by transglutaminase［J］.Dairy Science，2006，89:1906－1914.

［8］Jos'e M R.Enzymatic cross－linking of ewe’s milk proteins by transglutaminase［J］.Eur Food Res Technol，2005，221:692－699.

［9］Martin P B，Lauber S，Kulozik U.Improvement of enzymatic cross－linking of casein micelles with transglutaminase by glutathione addition［J］.International Dairy Journal，2007，17:3－11.

［10］姜淑娟，趙新淮.酪蛋白的轉谷氨酰胺酶氨基葡萄糖修飾與功能性變化［J］.中國乳品工業，2010，38(9):8－11.

［11］姜淑娟，馮鎮，趙新淮.酪蛋白的轉谷氨酰胺酶酶促糖基化交聯條件及產物性質［J］.中國乳品工業，2011，39(7):25－28.

［12］Jiang SJ，Zhao X H.Transglutaminas e－ induced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product［J］.International Dairy Journal，2011，21:198－205.

［13］趙新淮，李君文.過氧化物酶催化酪蛋白的交聯反應優化與乳化性改善［J］.農業機械學報，2009，40(11):144－149.

［14］李君文，趙新淮.阿魏酸存在下酪蛋白的酶促交聯與一些性質變化［J］.中國乳品工業，2010，38(3):7－9.

［15］吳進菊，高金燕，劉瀟，等.雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯作用對酪蛋白乳化性及其穩定性的影響［J］.食品科學，2010，31(15):117－120.

［16］Kuraishi C，Yamazaki K，Susa Y.Transglutaminase:Its utilizationin the food industry［J］.Food Rev Int，2001，17:221－246.

［17］SharmaR，LorenzenP C，QvistK B.Influenceof transglutaminase treatment of skim milk on the formation of epsilon－(gamma－glutamyl)lysine and the susceptibility of individual proteins towards crosslinking［J］.Int Dairy J，2001，11:785－793.

［18］O’Connell J E，de Kruif C G.β－Casein micelles;crosslinking with transglutaminase［J］.Colloids and Surfaces，2003，216:75－81.

［19］Monogioudi E，Creusot N，Kruus K，et al.Cross－linking of β－casein by Trichoderma reesei tyrosinase and Streptoverticillium mobaraense transglutaminase followed by SEC－MALLS［J］.Food Hydrocolloids，2009，23:2008－2015.

［20］E Monogioudi，G Faccio，M Lille，et al.Effect of enzymatic cross－ linking of－ casein on proteolysis by pepsin［J］.Food Hydrocolloids，2011，25:71－81.

［21］Vasbinder A J，Rollema H S，Bot A，et al.Gelation mechanism of milk as influenced by temperature and pH;studied by the use of transglutaminase cross－ linked casein micelles［J］.Dairy Science，2003，86:1556－1563.

［22］Mounsey J S，O’Kennedy B T，Kelly P M.Influence of transglutaminase treatment on properties of micellar casein and products made therefrom［J］.Lait，2005，85:405－418.

［23］Jaros D，Partschefeld C，Henle T，et al.Transglutaminase in dairy products:Chemistry，physics，applications［J］.Texture Study，2006，37:113－155.

［24］?zrenk E.The use of transglutaminase in dairy products［J］.International Journal of Dairy Technology，2006，59:1－7.

［25］O’Sullivan M M，Kelly A L，Fox P F.Influence of transglutaminase treatment on some physico－chemical properties of milk［J］.Dairy Research，2002，69:433－442.

［26］O’Sullivan M M，Lorenzen P C，O’Connell J E，et al.Influence of transglutaminase on the heat stability of milk［J］.Dairy Science，2001，84:1331－1334.

［27］Huppertz T，de Kruif C G.Ethanol stability of casein micelles cross－ linked with transglutaminase［J］.International Dairy Journal，2007，17:436－441.

［28］Partschefeld C，SchwarzenbolzU，RichterS，etal.Crosslinking of casein by microbial transglutaminase and its resulting influence on the stability of micelle structure［J］.Biotechnol，2007(2):456－461.

［29］Yin W W，Su R X，Qi W，et al.A casein－polysaccharide hybrid hydrogel cross－linked by transglutaminase for drug delivery［J］.J Mater Sci，2012，47:2045－2055.

［30］Aline C，Tezcucano M，InteazA，etal.Effectof dephosphorylation on bovine casein［J］.Food Chemistry，2007，101:1263－1271.

［31］李丹，趙新淮.酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其產物的金屬離子螯合能力［J］.食品與發酵工業，2010，36(11):21－25.

［32］張志，王旭，王強，等.不同因素對酪蛋白酶解產物與鋅鹽螯合效果的影響［J］.食品科學，2009，30(9):129－132.

［33］吳丹，李鐵晶，趙新淮.酪蛋白水解物的酶法修飾優化與抗氧化活性改善［J］.農業機械學報，2010，41(1):139－145.

［34］Otte J，Shalabya M S，Zakoraa M，et al.Angiotensinconverting enzyme inhibitory activity of milk protein hydrolysates:effect of substrate，enzyme and time of hydrolysis［J］.International Dairy Journal，2007，17(5):488－503.

［35］胡文琴，王恬.酪蛋白酶解物體外抗氧化作用的研究［J］.食品科學，2004，25(4):158－162.

［36］Zhao X H，WU D，Li T J.Preparation and radical scavenging activity of papain－ catalyzed casein plasteins［J］.Dairy Sci Technol，2010，90:521－535.

［37］陳東平，牟光慶.不同分子量酪蛋白肽對自由基清除作用研究［J］.中國釀造，2010，217(4):33－35.

［38］徐微，趙新淮.酪蛋白水解物的Plastein反應修飾及ACE抑制活性變化［J］.中國乳品工業，2011，39(4):8－11.

A review on enzymatic modification of casein micelle

YANG Min1，2，GAN Bo－zhong1，*，ZHANG Wei－bing1，LIANG Qi1，QIAO Hai－jun2
(1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;2.College of Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

The structure of casein micelle affects its stability.Enzymatic modification is a high security technology of protein structural modification which was studied extensively.This paper reviewed the recent researches on enzymatic modification of casein micelle.It also discussed the stability and functional properties of modified casein with the purpose of providing reference for dairy products.

casein micelle;enzymatic modification;enzymatic cross－linking;hydrolysis

TS252.1

A

1002－0306(2012)17－0413－04

2012－02－13 *通訊聯系人

楊敏(1981－)，女，在讀博士，講師，研究方向:乳品科學與技術。

國家自然科學基金資助項目(30960260);甘肅省自然科學研究基金計劃重點項目(1107RJZA227)。