烏賊墨多糖緩解環(huán)磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究

王 光，鐘杰平，劉華忠

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江 524088;3.廣東海洋大學(xué)生物化學(xué)中心，廣東湛江 524088)

烏賊墨多糖緩解環(huán)磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究

王 光1，鐘杰平2，劉華忠3，*

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江 524088;3.廣東海洋大學(xué)生物化學(xué)中心，廣東湛江 524088)

探討烏賊墨多糖(SIPS)對(duì)環(huán)磷酰胺所致骨髓功能抑制的緩解效應(yīng)。以SD大鼠為模型，灌服SIPS和腹腔注射環(huán)磷酰胺共處理，檢測(cè)大鼠外周血像和骨髓DNA含量。環(huán)磷酰胺不僅顯著降低了大鼠外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的數(shù)量以及血紅蛋白的含量，骨髓細(xì)胞DNA含量也被顯著下調(diào)(p＜0.01 or p＜0.05)。SIPS十分明顯的弱化了該化療藥物的骨髓抑制功能，環(huán)磷酰胺對(duì)以上指標(biāo)參數(shù)所導(dǎo)致的負(fù)效應(yīng)均被該海洋活性物質(zhì)不同程度的消減(p＜0.05 or p＜0.01)。SIPS可緩解環(huán)磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能抑制作用。

烏賊墨多糖，環(huán)磷酰胺，骨髓抑制，大鼠

當(dāng)前盡管已有多種腫瘤治療措施被相繼創(chuàng)立，但臨床上化療依然是最常采用的治療手段，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)就是其中一種廣泛被使用的抗腫瘤藥物。作為一種氮芥類(lèi)抗腫瘤藥物，CP在肝臟微粒體細(xì)胞色素P－450酶系代謝活化［1］。研究表明，高劑量CP通過(guò)損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能而誘導(dǎo)免疫抑制［1］、心臟毒性［2］、肺毒性［3］和骨髓功能抑制［4］等，因此，因其細(xì)胞毒性而導(dǎo)致化療藥物的臨床應(yīng)用受到了限制，結(jié)果使得癌癥治療效果顯著下降。因而，用于腫瘤臨床化療上的細(xì)胞保護(hù)劑的篩選與應(yīng)用迫在眉睫。多糖已被廣泛認(rèn)為是一類(lèi)多功能的

生物活性物質(zhì)，天然多糖根據(jù)來(lái)源不同可分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖。目前，大約300多種天然多糖已被分離鑒定，其中大部分被證實(shí)具有生物學(xué)活性。隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)海洋天然活性物質(zhì)的研究的增多，源自海洋生物的多糖正成為科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。這其中，烏賊墨多糖(squid ink polysaccharides，SIPS)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種海洋多糖，分離于烏賊墨汁。大量的研究結(jié)果證實(shí)，烏賊墨不僅具有抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、抗菌［7－8］、升白［9］等生物學(xué)活性，而且能保護(hù)小鼠骨髓和脾臟，弱化環(huán)磷酰胺對(duì)造血功能造成的損傷［4］。雖然先前的研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨對(duì)CP所致正常組織器官的毒性損傷具有緩解效應(yīng)［3－4，10］，但因?yàn)闉踬\墨是一種混合物，包含有色素、蛋白、脂類(lèi)和多糖等。為篩選其化療保護(hù)有效成分，本研究制備了SIPS，并和環(huán)磷酰胺共刺激大鼠，以大鼠的骨髓功能為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確證SIPS的化療保護(hù)功效。

1 材料與方法

1.1 SIPS的制備

SIPS 的制備方法參考先前的報(bào)道［11－12］。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

體重相近(155±10)g的10周齡健康SD大鼠適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后開(kāi)始接受實(shí)驗(yàn)處理。動(dòng)物房溫度為(26±2)℃，相對(duì)濕度為44%～45%，光暗周期為10h與14h。動(dòng)物隨機(jī)均分為8組，10只/組，雌雄各半。對(duì)照組(A)全實(shí)驗(yàn)期(15d)灌服生理鹽水，于第6d和7d腹腔注射生理鹽水兩次;模型組(B)分別于實(shí)驗(yàn)第6d和7d兩次腹腔注射CP(100mg/kg，溶于生理鹽水)，全程灌服生理鹽水;C、D組為SIPS和CP共處理組，該兩組大鼠全程分別灌服SIPS，劑量分別為60、120mg/kg(1次/d)，并且于第6、7d腹腔注射腹腔注射CP。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為15d，第16d處死大鼠，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 外周血像檢測(cè)

大鼠摘眼球取血，抗凝，血細(xì)胞自動(dòng)分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)量，以及血紅蛋白含量。

1.4 骨髓DNA含量檢測(cè)［4］

剝離小鼠左側(cè)后肢股骨，用眼科手術(shù)剪將股骨兩端剪斷，露出骨髓腔。用10mL 0.005mol/L CaCl2沖洗骨髓至離心管中，4℃冰箱放置30min，2500r/min離心15min。棄上清，加入0.2mol/L HClO4溶液5mL，振蕩混勻后，90℃加熱15min。快速冷卻至室溫，冷卻后過(guò)濾，紫外分光光度計(jì)測(cè)定268nm的吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉX±S)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血像

數(shù)據(jù)結(jié)果詳見(jiàn)圖1。相較于空白對(duì)照組，CP(100mg/kg)處理導(dǎo)致了大鼠外周血中紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)量以及血紅蛋白含量顯著下降(p＜0.01)。然而在SIPS和CP共處理組中，這四個(gè)參數(shù)卻出現(xiàn)了比模型組明顯的不同程度的提升，白細(xì)胞和血小板數(shù)量均顯著高于模型組(p＜0.05或p＜0.01)，對(duì)于紅細(xì)胞和血紅蛋白，明顯的變化見(jiàn)于SIPS 120mg/kg劑量組(p＜0.05)。

2.2 骨髓DNA含量

為進(jìn)一步探討SIPS對(duì)CP誘導(dǎo)的骨髓功能抑制的作用效果，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了骨髓細(xì)胞DNA含量，數(shù)據(jù)詳見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，盡管CP顯著下調(diào)了大鼠骨髓細(xì)胞DNA含量(p＜0.01)，但該下降趨勢(shì)卻被SIPS所抑制，其最終錨定的數(shù)據(jù)值明顯高于CP單獨(dú)處理的模型組大鼠(p＜0.05)。結(jié)果表明，SIPS能明顯改善CP對(duì)大鼠骨髓DNA的損傷，抑制骨髓有核細(xì)胞的減少，緩解CP對(duì)骨髓造血功能的毒性損傷。

3 討論

圖1 SIPS對(duì)環(huán)磷酰胺致大鼠外周血像變化的影響(n=10)Fig.1 Effect of SIPS on peripheral blood profile changes induced by CP in rats(n=10)

圖2 SIPS對(duì)環(huán)磷酰胺致大鼠骨髓細(xì)胞DNA含量變化的影響(n=10)Fig.2 Effect of SIPS on CP－indeced changes of DNA content in bone marrow from rats(n=10)

骨髓是人體最大的造血器官。造血干細(xì)胞是生成各種血細(xì)胞的原始細(xì)胞，具有很強(qiáng)的分裂增殖潛能，其在一定的微環(huán)境和某些因素的調(diào)節(jié)下增殖分化為各類(lèi)血細(xì)胞的造血祖細(xì)胞。血細(xì)胞發(fā)生是造血干細(xì)胞經(jīng)增殖、分化直至成為各種成熟血細(xì)胞的過(guò)程。當(dāng)機(jī)體受到某些外部因素的攻擊，如化療和放射，造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的增殖均將受到嚴(yán)重抑制。環(huán)磷酰胺是一種被臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，其作用靶標(biāo)為細(xì)胞快速分裂增殖組織或器官，因而，除兼?zhèn)洳凰佬浴⑥D(zhuǎn)移性和無(wú)接觸抑制性等特征的腫瘤細(xì)胞之外，尤其是對(duì)增殖活躍的骨髓造血干細(xì)胞作用特別強(qiáng)，主要破壞細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響骨髓造血干細(xì)胞的增殖、分化并抑制骨髓造血功能。

環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生活性氧(ROS)，啟動(dòng)下游多種反應(yīng)程序，導(dǎo)致氧化—抗氧化平衡向氧化方向傾斜，損傷生物高分子(如DNA、蛋白質(zhì))，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺顯著下調(diào)了外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)量以及血紅蛋白和骨髓DNA含量，表明環(huán)磷酰胺所致大鼠骨髓損傷模型構(gòu)建成功。

SIPS為從烏賊墨中分離制備的多糖，背景研究已經(jīng)揭示SIPS分子為帶有分支結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖，主鏈為葡萄糖醛酸—海藻糖(GlcA－Fuc)二糖單元的串聯(lián)重復(fù)，N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)分支于海藻糖，完整的三糖重復(fù)單元為{－3GlcAβ1－4(GalNAcα1－3)Fucα1－}n［14－15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIPS 能顯著改善環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠外周血像和骨髓DNA含量造成的負(fù)面影響，本文所示兩個(gè)劑量組中，高劑量組的保護(hù)效果明顯優(yōu)于低劑量組，而且，與本課題組前期報(bào)道的180mg/kg 的最高劑量組比較［16］，120mg/kg 劑量依然稍強(qiáng)，因此，在我們所做的60、120、180mg/kg三個(gè)劑量組中，120mg/kg為最適宜劑量。結(jié)果表明，SIPS能顯著緩解環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨髓造血功能所造成的抑制作用。

［1］COLVIN O M.An overview of cyclophosphamide development and clinical applications［J］.Curr Pharm Des，1999(5):555－560.

［2］SHANHOLTZ C.Acute life－threatening toxicity of cancer treatment［J］.Crit Care Clin，2001(17):483－502.

［3］王光，郭宜重，關(guān)淑冰，等.烏賊墨對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠肺纖維化保護(hù)作用研究［J］.中國(guó)海洋藥物，2009(1):36－40.

［4］ZHONG J P，WANG G，SHANG J H，et al.Protective effect of squid ink extracttowardshemopoietic injuriesinduced by cyclophosphamide［J］.Mar Drugs，2009(7):9－18.

［5］TAKAYA Y，UCHISAWAH，MATSUEH，etal.An investigation of the antitumor peptidogly can fraction from squid ink［J］.Biol Pharm Bull，1994(17):846－849.

［6］雷敏，王靜鳳，逄龍，等.烏賊墨對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝和抗氧化能力的影響［J］.中國(guó)海洋藥物，2007(3):30－33.

［7］FUNATSU Y，F(xiàn)UKAMI K，KONDO H，et al.Improvement of“kurozukuri ika－shiokara”(fermented squid meat with ink)odor with Staphylococcus nepalensis isolated from the fish sauce mush of frigate mackerel Auxis rochei［J］.Bull Jpn Soc Sci Fish，2005(71):611－617.

［8］SADOK S，ABDELMOULAH A，ABED AE.Combined effect of squid soaking and temperature on the shelf life of peeled shrimp Penaeus kerathurus［J］.Food Chem，2004(88):115－122.

［9］SASAKI J，ISHITA K，TAKAYA Y，et al.Antitumor activity of squid ink［J］.J Nutr Sci Vitaminol，1997(43):455－461.

［10］劉華忠，王光，吳金龍，等.烏賊墨對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠腎臟氧化性損傷的拮抗作用［J］.中華腎臟病雜志，2009(10):804－805.

［11］吳金龍，劉華忠，師莉莎，等.烏賊墨多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(7):289－291，296.

［12］師莉莎，劉華忠，吳金龍，等.酶法提取烏賊墨多糖工藝探討［J］.食品科技，2011(4):138－141，147.

［13］MOTAWI TMK，SADIK NAH，REFAAT A.Cytoprotective effects of DL－alpha－lipoic acid or squalene on cyclophosphamide－induced oxidative injury:An experimentalstudy on rat myocardium，testicles and urinary bladder［J］.Food Chem Toxicol，2010(8－9):2326－2336.

［14］TAKAYA Y，UCHISAWA H，NARUMI F，et al.Illexin A，B，and C from squid ink should have a branched structure［J］.Biochem Bioph Res Co，1996(226):335－338.

［15］CHEN SG，XU J，XUE CG，et al.Sequence determination of a non－sulfated glycosaminogly can－like polysaccharide from melanin－free ink of the squid Ommastrephes bartrami by negative－ion electrospray tandem mass spectrometry and NMR spectroscopy［J］.Glycoconj J，2008(25):481－492.

［16］閔詩(shī)剛，王光，鐘杰平，等.烏賊墨多糖對(duì)大鼠外周血及血液中抗氧化能力影響［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011(1):123－125.

Study on squid ink polysaccharides weakens the suppression of bone marrow induced by cyclophosphamide in rats

WANG Guang1，ZHONG Jie－ping2，LIU Hua－zhong3，*
(1.College of Food Science ＆ Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;2.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;3.Modern Biochemistry Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In orderto explore the amelioratory effects ofsquid ink polysaccharides(SIPS)towards cyclophosphamide－induced suppression of bone marrow functions.Sprague－Dawley rats were employed to be co－treated with intraperitoneal cyclophosphamide and oral SIPS.Peripheral blood profile and DNA content in bone marrow were detected.Cyclophosphamide decreased significantly the quantities of erythrocytes，leukocytes and platelets in blood，contents of hemoglobin in blood and DNA in bone marrow(p ＜0.01 or p ＜0.05).SIPS incoordinately impaired the negative changes induced by cyclophosphamide(p＜0.05 or p＜0.01).It was implied that SIPS could protect bone marrow from chemotherapeutical damage caused by cyclophosphamide.

squid ink polysaccharides;cyclophosphamide;suppression of bone marrow;rats

TS254.9

A

1002－0306(2012)17－0365－03

2012－01－12 *通訊聯(lián)系人

王光(1983－)，男，碩士研究生，主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171667)。