結核分支桿菌異煙肼耐藥性的雜交檢測

亓瑩

耐藥結核病已成為結核病防控、治療工作面臨的嚴峻挑戰。目前耐藥結核病的診斷主要依靠結核分枝桿菌培養、藥物敏感性實驗，試驗周期長，不能滿足臨床需要。異煙肼、利福平作為一線抗結核藥物，其耐藥性分子機制的研究成為熱點。有報道指出結核分支桿菌對異煙肼耐藥是由結核分支桿菌中過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的突變所致，與inhA基因突變也存在著密切聯系。我們采用PCR擴增、核酸雜交檢測方法對102株臨床結核桿菌分離株和35例結核患者菌陽痰標本進行KatG、inhA基因突變檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42株對異煙肼敏感的菌株，60株對異煙肼耐藥菌株、35例耐異煙肼或含耐異煙肼的肺結核患者菌陽菌陽痰標本來自我院就診的結核患者。異煙肼敏感株、耐藥株均通過結核分枝桿菌藥物敏感性試驗驗證。

1.2 方法

1.2.1 結核分枝桿菌DNA模板的制備 刮取少量標本，加入100ulTE中，100℃ 煮沸10min，立即置于冰上2min，10000rpm離心10min，取上清備用。

1.2.2 PCR擴增 采用20ul反應體系，Bio-標記引物，擴增程序為:經過變性、退火、延伸，30次循環，最后延伸72℃、10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(10ug/ml)。凝膠成像系統檢測，出現267 bp條帶。

1.2.3 雜交檢測 將點有探針的硝酸纖維素雜交膜裝入雜交袋中，加入雜交液進行預雜交:45℃、20min。將上一步PCR擴增陽性產物95℃、10min變性，取出迅速放入冰盒中，取變性擴增產物加入雜交袋中，每ml雜交液加l5ul變性的擴增產物，進行分子雜交:45℃、60 min。取出硝酸纖維素雜交膜，洗膜三次、加入顯色試劑顯色、與標準菌株對比觀察報告結果。

2 結果

2.1 肺結核患者痰標本的檢測結果 35例耐異煙肼肺結核患者痰標本中，KatG基因擴增陽性有30例、inhA基因擴增陽性27例。應用PCR擴增、核酸雜交檢測方法檢測KatG、inhA基因突變率分別為43.3%(13/30)、3.7%(1/30)。見表1。

表1 對35例痰標本的KatG、inhA基因突變檢測結果

2.2 結核分支桿菌臨床分離株的檢測結果 42株對異煙肼敏感菌株的KatG、inhA基因突變率分別為4.8%(2/42)、0。60株對異煙肼耐藥菌株中，38株發生KatG基因突變，突變率為61.6%;3株發生inhA基因突變，突變率為5.0%。

表2 對102例臨床分離株的檢測結果

3 討論

耐藥結核病已經成為我國結核病控制的一大難題，若不能有效遏制耐藥結核分枝桿菌的播散和流行，將會使更多人感染耐藥結核分枝桿菌并形成新的傳染源，應盡快提高我國耐藥結核病的診斷水平，引入新的快速、可靠和便捷的耐藥結核病的診斷技術，縮短耐藥結核病的診斷時間。研究表明結核分支桿菌耐異煙肼的分子機制是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變所致，與inhA基因突變也存在密切聯系。本文通過PCR擴增、核酸雜交方法進行KatG、inhA基因突變檢測，使耐藥性檢測時間由2～3個月縮短到2～3 d。

PCR擴增、核酸雜交技術檢測結核分枝桿菌的KatG、inhA基因突變，42株對異煙肼敏感菌株中，發生KatG基因突變的2株，沒有inhA基因突變。發生KatG、inhA基因突變率分別為4.8%、0。60株對異煙肼耐藥菌株中，與標準菌株相比，發生KatG基因突變38株，突變率為61.6%;發生inhA基因突變3株，突變率為5.0%，突變類型均為點突變。對異煙肼耐藥的肺結核患者菌陽痰標本中，KatG、inhA基因突變檢出率分別為43.3%(13/30)、3.7%(1/27)，略低于臨床分離株，這與相關報道一致。由于本實驗中有4.8%的敏感株也存在突變，說明KatG、inhA基因突變是導致異煙肼耐藥的主要原因，但有部分菌株的耐異煙肼形成可能與KatG、inhA基因缺失、突變無關，還需要進一步研究探討。本實驗也驗證了大部分結核分支桿菌對異煙肼耐藥是由KatG基因、inhA基因的突變所決定。

本文建立一種新的快速，有效的對異煙肼耐藥的分子檢測方法。為耐藥結核病的早期診斷、早期治療具有重要的意義。應用PCR擴增和核酸雜交檢測技術也可以直接檢測菌陽痰標本中結核桿菌KatG、inhA基因突變情況，來判斷結核分支桿菌異煙肼的耐藥性，為耐藥、耐多藥肺結核提供診斷依據。