DC-CIK聯合吉非替尼對A549細胞抑制作用分析

侯燕軍 張雷 吳啟龍 薛利利

分子靶向和免疫治療在治療腫瘤方面取得了重大療效，常用于肺癌的治療。由于吸煙，空氣污染，電離輻射等因素影響，肺癌的發生率及死亡率逐年上升肺癌占所有癌癥致死人數的比例超過1/5，并有上升趨勢[1]。本實驗旨在探索生物免疫治療與分子靶向治療的協同關系現報道如下:

1 材料與方法

1.1 材料 吉非替尼(國藥準字J20100014)由阿斯利康公司提供;A549人類肺腺癌細胞株由上海研生生物工程有限公司提供;DC-CIK共同培養為我細胞培養室自制，培養基為RPMI-1640由Hyclone提供;MTT儀器為上海華舜生物工程有限公司提供;胎牛血清由杭州四季清公司提供;Annexin-V/FIFC試劑盒由南京凱基生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 DC-CIK制備 采集健康志愿者外周血離心獲得單個核細胞。反復凍融裂解法制備抗原。室溫下培養3h后貼壁者做DC細胞培養，未貼壁者做CIK細胞培養。培養第9天以DC/CIK=1:5進行混合培養。

1.2.2 A549細胞培養 用Hyclone提供的含10%胎牛血清RPMI/1640的培養液于37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養A459細胞，2 d/次換液。細胞成片后作1/2傳代。

1.2.3 細胞抑制率測定 將對數期生長的A549細胞用MTT法計數后種于96孔板內，標準為每孔0.5×105。分為DC-CIK組、吉非替尼組、DC-CIK聯合吉非替尼A、B組(A組吉非替尼6.9umol/L;B組非替尼13.8umol/L)，培養24h待A549細胞貼壁，取出培養板，去除培養液，洗滌2～3次后，堿化標本，在570nm處測定OD值，每組實驗取4孔求平均值，根據添加藥物前后細胞計數的變化計數每組的抑制率。

1.2.4 細胞周期及凋亡情況測定 ①細胞凋亡測定:取對數生長期細胞，接種于6孔板中，培養后，收集細胞以1500r/min離心 5 min，棄上清，加入10 μl AnnexinV-FITC 和5μlPI輕輕混勻;室溫避光孵育 15min，后進行流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析細胞凋亡率。②細胞周期測定:取對數生長期細胞，接種于6孔板中。收集細胞，用冰PBS洗2遍，70%冰乙醇固定標本24 h后重復用冰PBS洗2遍，用500ul Binding Buffer重懸細胞。加入RNA酶使其終濃度達到100 μg/ml，后37℃水浴30 min，最后加入 PI使其濃度達50 μg/ml后4℃避光30 min，流式細胞儀檢測分析細胞周期。

1.3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 13.0對觀察的數據進行分析處理。

2 結果

吉非替尼組對A549細胞的抑制率最低為(37.19±1.5)%，DC-CIK聯合吉非替尼B組抑制率最高為(69.62±2.30)%，各組實驗結果差異顯著，有統計學意義，P＜0.05。

表1 各組實驗對A549細胞的周期凋亡影響(%)

表2 各組實驗對A549細胞的周期凋亡影響(%)

3 討論

隨著社會科技的迅猛發展，環境污染逐漸嚴重加上吸煙等因素導致肺癌發病率逐年上升，非小細胞肺癌占肺癌總數的80%～85%，所以非小細胞肺癌的治療已是迫在眉睫的重要任務。樹突狀細胞(DC)是最有效的抗原呈遞細胞，能攝取、加工并呈遞抗原給T細胞引發細胞免疫。CIK細胞是免疫反應中的非特異性殺傷細胞，可由多種細胞因子誘導T細胞分泌，CIK細胞可迅速分泌多種免疫因子參與免疫反應。而將樹突狀細胞與CIK細胞聯合培養后可促進CIK細胞成熟，增強CIK細胞的殺傷力可以確保高效的免疫反應[2]。吉非替尼是酪氨酸激酶的抑制劑，用于非小細胞肺癌的治療。兩者合用對非小細胞肺癌起明顯作用的機制可能因為腫瘤相關成纖維細胞(TAFs)活化受到抑制的因素。因為腫瘤相關成纖維細胞活化后會促進腫瘤細胞的轉移擴散，增加了腫瘤細胞的惡性表型，并對腫瘤血管的生長，浸潤起促進作用。對于兩者如何作用于腫瘤相關成纖維細胞筆者將進一步實驗論證。

[1]尤長宣，李金瀚.28例吉非替尼一線治療老年非小細胞肺癌的臨床經驗．中國腫瘤臨床，2010，37(11):34-35．

[2]葛薇，張偉.樹突細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞共培養增強其體內外抗腫瘤活性．中華血液學雜志，2004，25(5):117．