DC-CIK聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞抑制作用分析

侯燕軍 張雷 吳啟龍 薛利利

分子靶向和免疫治療在治療腫瘤方面取得了重大療效，常用于肺癌的治療。由于吸煙，空氣污染，電離輻射等因素影響，肺癌的發(fā)生率及死亡率逐年上升肺癌占所有癌癥致死人數(shù)的比例超過(guò)1/5，并有上升趨勢(shì)[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索生物免疫治療與分子靶向治療的協(xié)同關(guān)系現(xiàn)報(bào)道如下:

1 材料與方法

1.1 材料 吉非替尼(國(guó)藥準(zhǔn)字J20100014)由阿斯利康公司提供;A549人類肺腺癌細(xì)胞株由上海研生生物工程有限公司提供;DC-CIK共同培養(yǎng)為我細(xì)胞培養(yǎng)室自制，培養(yǎng)基為RPMI-1640由Hyclone提供;MTT儀器為上海華舜生物工程有限公司提供;胎牛血清由杭州四季清公司提供;Annexin-V/FIFC試劑盒由南京凱基生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DC-CIK制備 采集健康志愿者外周血離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。反復(fù)凍融裂解法制備抗原。室溫下培養(yǎng)3h后貼壁者做DC細(xì)胞培養(yǎng)，未貼壁者做CIK細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)第9天以DC/CIK=1:5進(jìn)行混合培養(yǎng)。

1.2.2 A549細(xì)胞培養(yǎng) 用Hyclone提供的含10%胎牛血清RPMI/1640的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)A459細(xì)胞，2 d/次換液。細(xì)胞成片后作1/2傳代。

1.2.3 細(xì)胞抑制率測(cè)定 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549細(xì)胞用MTT法計(jì)數(shù)后種于96孔板內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)為每孔0.5×105。分為DC-CIK組、吉非替尼組、DC-CIK聯(lián)合吉非替尼A、B組(A組吉非替尼6.9umol/L;B組非替尼13.8umol/L)，培養(yǎng)24h待A549細(xì)胞貼壁，取出培養(yǎng)板，去除培養(yǎng)液，洗滌2～3次后，堿化標(biāo)本，在570nm處測(cè)定OD值，每組實(shí)驗(yàn)取4孔求平均值，根據(jù)添加藥物前后細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化計(jì)數(shù)每組的抑制率。

1.2.4 細(xì)胞周期及凋亡情況測(cè)定 ①細(xì)胞凋亡測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)后，收集細(xì)胞以1500r/min離心 5 min，棄上清，加入10 μl AnnexinV-FITC 和5μlPI輕輕混勻;室溫避光孵育 15min，后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡率。②細(xì)胞周期測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板中。收集細(xì)胞，用冰PBS洗2遍，70%冰乙醇固定標(biāo)本24 h后重復(fù)用冰PBS洗2遍，用500ul Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入RNA酶使其終濃度達(dá)到100 μg/ml，后37℃水浴30 min，最后加入 PI使其濃度達(dá)50 μg/ml后4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)觀察的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

吉非替尼組對(duì)A549細(xì)胞的抑制率最低為(37.19±1.5)%，DC-CIK聯(lián)合吉非替尼B組抑制率最高為(69.62±2.30)%，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

表1 各組實(shí)驗(yàn)對(duì)A549細(xì)胞的周期凋亡影響(%)

表2 各組實(shí)驗(yàn)對(duì)A549細(xì)胞的周期凋亡影響(%)

3 討論

隨著社會(huì)科技的迅猛發(fā)展，環(huán)境污染逐漸嚴(yán)重加上吸煙等因素導(dǎo)致肺癌發(fā)病率逐年上升，非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%～85%，所以非小細(xì)胞肺癌的治療已是迫在眉睫的重要任務(wù)。樹突狀細(xì)胞(DC)是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，能攝取、加工并呈遞抗原給T細(xì)胞引發(fā)細(xì)胞免疫。CIK細(xì)胞是免疫反應(yīng)中的非特異性殺傷細(xì)胞，可由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌，CIK細(xì)胞可迅速分泌多種免疫因子參與免疫反應(yīng)。而將樹突狀細(xì)胞與CIK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后可促進(jìn)CIK細(xì)胞成熟，增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷力可以確保高效的免疫反應(yīng)[2]。吉非替尼是酪氨酸激酶的抑制劑，用于非小細(xì)胞肺癌的治療。兩者合用對(duì)非小細(xì)胞肺癌起明顯作用的機(jī)制可能因?yàn)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(TAFs)活化受到抑制的因素。因?yàn)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞活化后會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，增加了腫瘤細(xì)胞的惡性表型，并對(duì)腫瘤血管的生長(zhǎng)，浸潤(rùn)起促進(jìn)作用。對(duì)于兩者如何作用于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞筆者將進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

[1]尤長(zhǎng)宣，李金瀚.28例吉非替尼一線治療老年非小細(xì)胞肺癌的臨床經(jīng)驗(yàn)．中國(guó)腫瘤臨床，2010，37(11):34-35．

[2]葛薇，張偉.樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)其體內(nèi)外抗腫瘤活性．中華血液學(xué)雜志，2004，25(5):117．