熒光原位雜交技術在多發性骨髓瘤中的應用

楊渝偉 薛冰蓉 陳小紅 俸家富

四川省綿陽市中心醫院檢驗科，四川綿陽 621000

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以骨髓中克隆性漿細胞惡性增殖和異常積累為特征的腫瘤，約占血液腫瘤的10%。染色體異常在該病中有極高的發生率且有獨立的預后判斷價值，但是傳統細胞遺傳學方法檢測到染色體異常率只占初診患者的1/3左右。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術能對間期細胞進行分析，克服傳統方法的缺陷，大大提高核型異常檢出率。本研究應用該技術檢測39例MM初診患者，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年6 月～ 2009 年9月四川省綿陽市中心醫院MM初診患者39例，其中男24例，女15例，年齡36～80歲，中位年齡61.5歲。診斷標準依據中國多發性骨髓瘤工作組發布的《中國多發性骨髓瘤診治指南》（2008版）[1]。ISS分期Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例；DS分期Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例；免疫球蛋白類型IgG型19例，IgA型10例，輕鏈型7例，不分泌型3例。對照組15例為非血液系統惡性疾病患者，其中男9例，女6例，年齡26～65歲，中位年齡57.5歲。

1.2 探針

多發性骨髓瘤FISH檢測試劑盒購自北京金菩嘉生物有限公司，內含針對1q21區帶的序列特異性探針1q21、針對13q14區帶的序列特異性探針RBl（視網膜神經膠質瘤基因）和D13S319、針對14q32區帶的序列特異性探針IGH和針對17p13區帶的特異性探針p53。標記探針-20℃保存備用。

1.3 標本的處理

選取新鮮骨髓涂片（涂片均勻、勿厚）晾干后，56℃烤片10～20 min，100%甲醇浸泡5 min，100%乙酸浸泡30 min，室溫2xSSC液洗片2次各5 min，56℃老化玻片30～60 min或室溫下過夜老化玻片。老化好的玻片先后置37℃新鮮配制的RNase A溶液和鹽酸胃酶溶液中分別孵育30 min和10 min，2xSSC溶液洗片2次各5 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脫水各2 min，晾干后加熱至56℃，進行雜交試驗。

1.4 原位雜交

在暗室按照檢測試劑盒操作說明配制探針，73℃70%甲酰胺變性6 min，置45～50℃環境中備用。老化好的玻片置73℃70%甲酰胺中變性6 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脫水各3 min，晾干，置45～50℃烤片機上預熱2～5 min，將10μL變性后的探針滴加于雜交區域，加蓋蓋玻片（避免產生氣泡），42℃密封過夜。雜交后的玻片依次置于46℃50%（v/v）甲酰胺/2x SSC溶液和2x SSC溶液中洗滌，室溫70%乙醇浸泡3 min。晾干后，DAPI復染15 min，封片。

1.5 結果觀察

熒光顯微鏡下觀察，通過Imstar FISH軟件控制的CCD（ProgRes MFcool）攝取圖像，每例分析100～200個間期細胞核。IGH探針正常顯示2個紅色和綠色融合的黃色熒光雜交信號，出現分離的紅色或綠色熒光雜交信號為IGH重排；RBl、D13S319、p53和lq21探針正常均顯示2個紅色或綠色雜交信號，無或僅有1個雜交信號為該探針缺失，具有3個及以上雜交信號的則為該探針擴增。

1.6 結果判斷

以15例非血液系統惡性疾病患者為對照組，計算各探針陽性細胞表達率的均值（x）和標準差（SD），并以x+3SD為陽性閾值。對于MM患者，其FISH檢測的陽性細胞表達率大于閾值判定為陽性結果，小于閾值判定為陰性結果。

1.7 統計學處理

應用SPSS17.0統計軟件對樣本率進行x2檢驗和Spearman相關系數分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各探針陽性閾值的建立

對15例非血液系統惡性疾病患者的骨髓樣本，每例分析100～200個間期核細胞，得到各探針陽性細胞表達率，計算均值（x）和標準差（SD），以x+3SD為陽性閾值。見表1。

表1 各染色體探針雜交信號陽性閾值

2.2 39例MM患者探針異常表達分析

39例MM患者應用5種探針的檢測情況如圖1，A-C所示。各探針異常表達情況分析結果（表2）顯示，1q21擴增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的檢出例數（率）分別為 24例（61.5%）、15例（38.5%）、18例（46.2%）、8例（20.5%）和13例（33.3%）。總共31例（79.5%）存在染色體異常，23例（59.0%）存在至少兩處染色體異常。Spearman相關性分析發現，lq21擴增與p53缺失呈顯著性正相關（r=0.359，P=0.035）；RB1和D13S319同時缺失15例，呈顯著性正相關（r=0.854，P=0.000）。

表2 39例MM患者5種探針異常表達情況分析

圖1 5種探針的檢測情況

2.3 染色體異常與分型、分期情況

染色體異常與分型、分期的情況見表3。結果顯示：除IGH重排與DS分期之間（r=0.434，P=0.007）、p53缺失與IIS分期之間（r=-0.448，P=0.006）和D13S319缺失與免疫學分型之間（r=-0.335，P=0.040）呈顯著相關性外，其余染色體異常與D-S分期、IIS分期和免疫學分型均無相關性。

3 討論

早期對MM細胞的細胞遺傳學和分子細胞遺傳學研究表明，幾乎所有的MM都存在克隆性染色體異常，且多為復雜核型異常，其中最為常見的是1、13、14和17號染色體結構或數目異常。本研究選用lq21、RBl、D13S319、p53和IGH共5種特異性探針檢測異常表達率較高的1q2l擴增、13q14缺失、17p13缺失以及14q32易位。

研究結果顯示，MM患者1q21擴增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的檢出率分別為61.5%、38.5%、46.2%、20.5%和33.3%，其中發生率最高的是1q21擴增，其次是D13S319缺失。79.5%患者均存在染色體異常，其中復雜核型異常占59.0%。由于常規顯帶只有約1/3的患者檢測結果為陽性[2]，因此FISH技術相比傳統檢測方法，明顯提高了核型異常的檢出率，并證實MM的核型異常多為復雜核型異常。

表3 染色體核型異常與分型、分期之間關系[n（%）]

1q21區域存在與MM患者緊密相關的基因簇，其中包括IL-6受體基因，MM患者在受累的IL-6基因作用下，致使IL-6受體數目基因量效性增加，促進骨髓中漿細胞增殖分泌大量β2-MG，預后差、生存期短[3]。此外，CKSlB基因亦位于lq21區域，屬于Cks/Sucl蛋白家族，能通過Skp2和p27K-依賴和非依賴機制促進MM瘤細胞的增殖，是MM預后不良因子[4-5]。研究顯示1q21擴增的發生率為61.5%，高于國外研究結果，但與國內報道相符[6-7]，說明中國人群MM患者lq21擴增比例較高。

RB1（13q14）和D13S319（13q14.3）是檢測13q14缺失的兩個主要部位。13q14缺失在MM發病機制中起重要作用，同時也是預示生存期短的重要指標，尤其是合并血清β2-MG升高者[8-9]。結果顯示，13q14缺失的發生率為46.2%，但是13q14缺失與1q21擴增之間無相關性（r=0.309，P=0.098），與文獻報道不符，有待于進一步擴大病例數來得出更精確的結論。

p53缺失并非MM特有的異常。研究結果顯示，p53缺失在MM患者中的發生率為20.5%，在IIS分期中存在顯著性差異（x2=7.169，P=0.021），且與IIS分期呈顯著性負相關（r=-0.448，P=0.006），說明17p13缺失是疾病過程中較少的繼發事件，且多發生在III期。Spearman相關性研究顯示，p53缺失與lq21擴增呈顯著正相關（r=0.359，P=0.035），結果支持近來國外研究報道：17p13缺失與1q21擴增共同參與激活血管新生級聯反應，使骨髓微環境中的微循環血量增加，可能是導致MM發病的重要機制[10]。

14q32易位的發生率為33.3%，略低于相關的文獻報道。14q32 易位機制較為復雜，包括 t（11；14）（q13；q32），t（4；14）（p16.3；q32.3），t（14；18）（q32.3；q21.3）等，主要涉及編碼免疫球蛋白重鏈（IGH）的重鏈基因[11]，FISH結果均表現為兩個分離的紅/綠雜交信號。大量實驗證實存在t（11；14）患者預后稍好，伴有t（4；14）的患者預后較差。IGH探針雖然能夠發現14q32易位，卻不能表明與哪條染色體進行了易位重排，其預后價值有待進一步證實。對MM分期研究結果顯示，IGH重排在疾病分期中有顯著性差異，且與D-S分期呈顯著性正相關（r=0.434，P=0.007）。在所研究的5種染色體探針中，D-S分期I期的MM患者有3/7例僅表達出IGH重排異常。這些結果均說明IGH重排是MM染色體異常的一個早期事件。

綜合上述，lq21擴增、13q14缺失、p53缺失及IGH重排是MM常見的核型異常，前三者是MM發展及預后的不良因素。FISH技術是檢測分子遺傳學異常高度敏感的方法，應當作為評估MM常規檢查。

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