熒光光度法測定福建組培金線蓮中總黃酮含量

羅明可 吳水華 柯伙釗

福建生物工程職業技術學院，福建福州 350002

金線蓮[anoectochilus roxburghii （wall.）lindl.][1]為蘭科開唇蘭屬植物，又名金線蘭、金線草等，民間素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱，是福建省和臺灣等地極其珍貴、稀少的中藥材。金線蓮全草藥用，味甘、性平，具有顯著的清熱解毒、祛風除濕、涼血平肝、固腎等功效[2-3]。鑒于野生金線蓮具有廣泛的臨床應用價值，同時為了保護野生資源，近年來福建省已成功開發了金線蓮組培快繁技術，并建立了多個金線蓮組培基地。目前，對福建組培金線蓮的研究主要集中在組培技術的優化方面，而對其活性成分的研究，僅有羅明可等[4]報道。為進一步考察福建組培金線蓮的內在質量，本實驗參考文獻[5-9]，首次采用熒光光度法對福建組培金線蓮中的總黃酮含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Cary Eclipse型熒光分光光度計（美國瓦里安）；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-100B型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；AKRY-UP-Ⅲ-10型超純水機（成都康寧實驗專用純水設備廠）。所用玻璃儀器均用重鉻酸鉀洗液浸泡24 h后，再先后用自來水、超純水沖洗干凈。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量為97.4%）；冰醋酸（HAc）、石油醚（60～90℃）、95%乙醇、結晶氯化鋁均為分析純；分析所用水均為超純水。福建組培金線蓮鮮草購自福建醫科大學附屬協和醫院，經干燥后粉碎過2號篩備用。

2 實驗方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 槲皮素標準溶液制備 精密稱取槲皮素對照品10 mg，置小燒杯中，用少量95%乙醇溶解后，轉入100 mL量瓶中，再用95%乙醇定容至刻度，搖勻，制得濃度為0.1 mg/mL的槲皮素標準溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 精密稱取福建組培金線蓮藥粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，加石油醚（60～90℃）20 mL浸泡24 h后，

2.1.3 試劑溶液制備 醋酸乙醇溶液：精密量取1.43 mL HAc，置50 mL量瓶中，用95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，制得0.5 mol/L的醋酸乙醇溶液，備用。三氯化鋁乙醇溶液：精密稱取0.912 2 g AlCl3·6H2O，置小燒杯中，用95%乙醇溶解后，轉入50 mL量瓶中，再用95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，制得10 mg/mL的三氯化鋁乙醇溶液，備用。

2.2 實驗條件選擇

2.2.1 測定波長的選擇 對槲皮素標準溶液及樣品溶液進行激發光譜和發射光譜掃描，所得譜圖如圖1所示。槲皮素和樣品在酸性條件下都與AlCl3反應產生熒光物質，激發波長（λex）分別為435 nm和433 nm，發射波長（λem）分別為485 nm和482 nm。因此，確定測定波長：激發波長為435 nm，發射波長為485 nm，狹縫寬度為5 nm。

圖1 槲皮素標準溶液及樣品溶液熒光光譜圖

2.2.2 體系醋酸濃度 在槲皮素、三氯化鋁條件不變的情況下，考察了體系中不同醋酸濃度對熒光強度的影響。由圖2可知，在本實驗中，當體系中醋酸的摩爾濃度較低時，隨醋酸摩爾濃度的增大，熒光強度迅速增加，當加入醋酸的摩爾濃度達到0.05 mol/L時，熒光強度達到最大值，然后隨著醋酸摩爾濃度的增大，熒光強度降低，故本實驗確定加入HAc的量為使體系的醋酸濃度達到0.05 mol/L。

2.2.3 體系三氯化鋁濃度 在槲皮素、HAc的條件不變的情況下，考察了體系中不同AlCl3濃度對熒光強度的影響。見圖3。在本實驗中，當體系中AlCl3的濃度較低時，隨AlCl3濃度的增大，熒光強度增強，當加入AlCl3的濃度在0.6～0.7 mg/mL時，熒光強度達到最大值，而后隨著AlCl3濃度的增加，熒光強度緩慢降低。故本實驗選擇加入AlCl3的量為使體系中AlCl3的濃度為0.6 mg/mL。

圖2 醋酸濃度的影響

圖3 AlCl3濃度的影響

2.2.4 體系乙醇濃度 在槲皮素、HAc和AlCl3的條件不變的情況下，考察了不同濃度乙醇對熒光強度的影響。見圖4。由圖可知，乙醇的濃度對熒光強度的影響比較大，濃度越高，熒光強度越強，故本實驗選擇95%乙醇作為溶劑。

圖4 乙醇濃度的影響

2.2.5 體系試劑加入順序 按上述選定條件，考察了試劑加入順序對熒光強度的影響，結果表明：分別按槲皮素+HAc+AlCl3、AlCl3+HAc+槲皮素、HAc+槲皮素+AlCl3的順序加入，三者熒光強度均較強，無顯著差別（RSD=1.0%），而其余加入順序的熒光強度均較弱。故本實驗選擇按槲皮+HAc+AlCl3的順序加入。

2.2.6 體系穩定性 槲皮素和樣品的熒光體系在不同測定時間內熒光強度的變化情況見圖5。由圖可知，二者熒光強度開始時迅速增強，5～20 min達到穩定，而后隨著時間的延長，熒光強度平緩下降，故顯色后5～20 min為最佳測定時間，故本實驗選擇顯色10 min時測定。

圖5 放置時間的影響

2.3 測定方法

2.3.1 工作曲線的繪制及檢出限的測定 精密量取1.0 mL槲皮素標準溶液，置50 mL量瓶中，用95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻。精密量取稀釋液 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mL，分別置于10 mL的量瓶中，再分別依次加入0.5 mol/L的HAc乙醇溶液1 mL，10 mg/mL的AlCl3乙醇溶液0.6 mL，用95%乙醇稀釋定容至刻度。室溫放置10 min。在上述確定的測定波長下測定熒光強度，并對相應的濃度繪制工作曲線。結果表明，在0.002～0.400 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，回歸方程為F=2 002.6C+5.529 6，相關系數r=0.999 5。經測定，此方法的檢出限為0.000 4 μg/mL。見圖6。

圖6 工作曲線

2.3.2 樣品測定和回收率實驗 按上述最佳實驗條件平行測定了福建組培金線蓮中總黃酮的含量，并對樣品溶液進行平行測定（n=5），按干燥品（經測得福建組培金線蓮的含水量為11.3%）計算含量。見表1。

表1 福建組培金線蓮總黃酮含量測定結果

為了驗證實驗的準確性，在樣品溶液中加入槲皮素對照品后計算回收率（按未扣除福建組培金線蓮中的水分計算含量），由表2可知，采用熒光光度法測定福建組培金線蓮中的總黃酮含量，實驗結果準確度高。

表2 樣品回收率實驗結果

3 討論

從福建野生金線蓮中得到大量黃酮類化臺物，主要由槲皮素、異鼠李素及其糖苷組成，推測黃酮為該植物中主要活性成分[7-8]。故本實驗以黃酮為測定對象，以槲皮素為對照品，測定福建組培金線蓮中的總黃酮含量，用以考察福建組培金線蓮的內在質量。

利用正交試驗設計，以紫外分光光度法檢測，對福建組培金線蓮總黃酮提取率作了詳細考察，得出最佳提取條件，即用40倍量石油醚（60～90℃）浸泡24 h，除去石油醚后，再用20倍量95%乙醇，超聲提取3次，每次30 min，加樣回收率為100.33%，RSD為1.03%。認為本實驗中總黃酮提取較為完全。

福建組培金線蓮中富含多酚類物質[9]，若直接用硝酸鋁比色法測定其中的總黃酮含量，會使測定結果偏高。采用熒光光度法測定福建組培金線蓮中的總黃酮含量，可排除一些常見金屬離子的干擾。同時，通過考察溶劑、pH值、三氯化鋁加入量、試劑加入順序、放置時間等因素對熒光強度的影響，進一步提高了測定結果的準確性。

本法操作簡便、快速，測定靈敏，結果準確、可靠，檢出限比紫外分光光度法及高效液相色譜法低了兩個數量級，適用于福建組培金線蓮中總黃酮的測定，為正確制定福建組培金線蓮的質量標準及合理開發利用提供依據。

[1]福建中醫藥研究所.福建藥物志[M].第2冊.福州：福建科技出版社，1982：215.

[2]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編（下冊）[M].北京：人民衛生出版社，1992.

[3]江川，黃玉芳.簡述民間草藥金線蓮的藥理作用[J].海峽藥學，2007，19（11）：87-88.

[4]羅明可，陳文娟，吳水華，等. GC-MS對不同溶劑萃取福建組培金線蓮揮發油的分析 [J]. 時珍國醫國藥，2010，21（9）：2192-2194.

[5]郭玉梅，楊景和，吳霞.銀杏葉提取物中總黃酮含量的分析方法研究[J].山東大學學報，2009，44（5）：40-44.

[6]張志信，張 鐵，趙保發，等.文山野生金線蓮總黃酮及多糖含量測定[J].時珍國醫國藥，2009，20（6）：1362-1364.

[7]關璟，王春蘭，郭順星，等.福建金線蓮總黃酮提取工藝的研究[J].中國藥學雜志，2008，43（21）：1615-1617.

[8]關 璟，王春蘭，郭順星，等.福建產金線蓮中黃酮苷成分的研究[J].中草藥，2005，36（10）：1450-1453.

[9]關璟，王春蘭，郭順星，等.高效液相色譜法測定金線蓮中黃酮含量[J].藥物分析雜志，2008，28（1）：9-11.