正交實驗法優選青皮的醇提工藝

朱 玉 王超群 王曉華

安徽省醫學科學研究院，安徽合肥 230061

正交實驗法優選青皮的醇提工藝

朱 玉 王超群 王曉華▲

安徽省醫學科學研究院，安徽合肥 230061

目的優選青皮的最佳醇提工藝。方法以橙皮苷為標樣，采用HPLC歸一化法測定出的總黃酮提取率為考察指標，先比較不同濃度的乙醇對青皮的提取效果，然后采用L9（34） 正交試驗法，考察乙醇用量、提取時間及提取次數對提取效果的影響。結果60%乙醇的提取效果最好，提取次數對考察指標具有顯著性影響。結論青皮的最佳醇提工藝為加8倍藥材量的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.0 h。

正交試驗；青皮；醇提工藝；橙皮苷；總黃酮；高效液相法

青皮（pericarpium citri reticulatae viride）為蕓香科植物橘（citrus reticulata blanco）及其栽培的干燥幼果或未成熟果實的果皮，性味苦、辛、溫，歸肝、膽、胃經，具有疏肝破氣、消積化滯之功能，用于胸脅脹痛、疝氣、乳核、乳癰、食積腹痛[1]。青皮中含有黃酮類、氨基酸類、胺類及揮發油等成分[2]，其中含量特別高的黃酮類化合物是橙皮苷[3]；青皮醇提取物或生物活性黃酮類混合物（橙皮苷和柚皮苷）可降低鼠血漿和肝膽固醇， 肝甘油三酯水平及3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶和酰基輔酶A膽固醇轉移酶（ACA T）的活性， 同時動物排泄物中性膽固醇含量也明顯減少[4]。雖然有青皮總黃酮提取工藝研究的報道[5-6]，但是其總黃酮含量采用分光光度法準確度較低、重復性差[7]。本研究以橙皮苷為標樣，采用HPLC歸一化法測定出的總黃酮提取率為考察指標，采用正交試驗法優選青皮醇提工藝，以期獲得更可靠的結論。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters-600E型液相色譜儀配996型PDA二極管陣列紫外檢測器（美國WATERS公司）；百萬之一電子天平（美國PE公司）；SB2200-T型超聲波清洗器（上海奧特賽恩斯儀器公司）；可控硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0721-200010，供含量測定用）；青皮飲片（合肥和義堂中藥飲片有限責任公司，批號：10010702）；甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 以橙皮苷為標樣，采用歸一化法計算青皮總黃酮含量[7]

2.1.1 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱：Shim-Pack VPODS（250 mm×4.6 mmI.D.，日本島津有限公司）；流動相：甲醇-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長283 nm。見圖1。本批青皮飲片中總黃酮的含量為9.13%。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升溶液含橙皮苷0.1 mg。

2.1.3 供試品溶液的制備 將青皮飲片粉碎成細粉，精密稱取0.2 g，置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即可。

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取橙皮苷對照品溶液（每毫升含橙皮苷0.010 04～0.100 4 mg）各20μL，分別注入液相色譜儀中，測定其色譜峰面積積分值。以橙皮苷對照品進樣量C（μg）為橫坐標，相應色譜峰面積積分值A為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程A=1.890×106C +2.438×104，相關系數r=0.999 5。橙皮苷的線性范圍0.200 8～2.008μg。

圖1 RP-HPLC圖

2.1.5 重復性試驗 取橙皮苷對照品溶液，連續進樣5次，測定其橙皮苷峰面積，結果相對標準偏差RSD為0.6%。

2.2 乙醇濃度的選擇

取青皮飲片 10.0 g，分別加入 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇150 mL，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，趁熱過濾，放冷，準確測量提取液體積，搖勻，精密量取1.5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，超聲處理10 min，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，分別注入液相色譜儀測定。結果顯示60%乙醇對青皮總黃酮的提取效果最好，青皮總黃酮的提取率為30.1%。

2.3 正交試驗設計

試驗采用L9（34）正交方案，試驗因素及其水平見表1。

表1 試驗因素水平表

2.4 樣品的提取

精密稱取9份青皮飲片，每份10.0 g，按正交設計表所列條件加入一定體積的60%乙醇，加熱回流提取一定時間后，趁熱過濾，合并提取液，放冷，準確測量提取液體積，備用。

2.5 青皮總黃酮提取率的測定

將各試驗提取液搖勻，精密量取適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，超聲處理10 min，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，分別注入液相色譜儀測定。

2.6 正交試驗結果及統計分析

青皮總黃酮提取率的影響因素大小順序為C＞A＞B，即提取次數＞乙醇用量＞提取時間；因素C具有顯著性影響，而因素A和B的影響不顯著。其中，K3a＞K2a＞K1a，但三者相差不大，故因素A選擇中間水平2，即60%乙醇的用量為8倍；K3b＞K2b＞K1b，三者相差不大，而且因素B對檢測指標影響不顯著，宜選擇中間水平2，即提取時間為1.0 h；K3c＞K1c＞K2c，三者相差較大，而且因素C對檢測指標影響顯著，宜選擇水平3，即提取次數為3次，因此，青皮的最佳醇提工藝為A2B2C3組合即5號正交試驗，青皮總黃酮提取率達為56.31%。見表2、3。

表2 L9（34）正交試驗表及結果

表3 方差分析表

3 討論

筆者曾嘗試以橙皮苷提取率作為考察指標，但是難免以偏蓋全，因為分析發現各樣品中不同成分峰面積之間的比例隨著不同提取工藝而變化，而以橙皮苷為標樣，采用HPLC歸一化法測定出的總黃酮提取率為考察指標，則較為全面。此法對于大批量青皮提取物的生產過程質量監控、中間產物質量檢驗亦較為合適。

文獻報道，采用Ca（OH）2飽和溶液提取青皮總黃酮，得到的青皮總黃酮含量為6.11%[5]，但提取過程涉及酸堿，不利于青皮黃酮類化合物天然結構的穩定；采用70%乙醇在70℃浸提的醇提方法，黃酮類化合物的提取率僅為5.56%[6]。本試驗優選的醇提工藝青皮總黃酮提取率達到55%以上，可見，加8倍藥材量的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.0 h作為青皮醇提工藝是可取的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S]. 北京：化學工業出版社，2005：136-137．

[2]Cheng H，Liu CY，Li CY.Advances in studies on chemical constituents and pharmacologic effects of Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J]. Chin Tradit Herb Drugs，2001， 32（11）：1050-1052.

[3]Yi LC，Xie PS，Liang YZ，et al.Studies on fingerprints of Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].Tradit Chin Drug Res Clin Pharm，2004，15（6）：403-406.

[4]Bok SH，Lee SH，Park YB，et al.Plasma and hepatic cholesterol and hepatic activities of 3-hydroxy-3-methyl-glu-taryl-CoA reductase and acyl CoA：cholesterol transferase are lower in rats fed citrus peel extract or a mixture of citrus bioflavonoids[J].J Nutr，1999，129 （6）：1182-1185.

[5]Zheng YM，Xu XY， Fu SQ， et al. Extraction and determination of total flavonoids from Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].West China Journal of pharmaceutical sciences，2007，22（5）：580-581.

[6]Zen H. Extraction of flavonoids from Pericarpium Citri Reticulatae Viride [J].Guiding J Tradit Chin Med Pharm，2009，15（6）：94-97.

[7]Zeng L，Zeng FJ，Wang W，et al.The determination for flavoneinl in Ginkgobilogal by HPLC[J]. Food Res Devel，2008，29（6）：85-88.

Orthogonal test for optimizing the extracting method of Pericarpium Citri Reticulatae Viride with alcohol

ZHU Yu WANG Chaoqun WANG Xiaohua
Anhui Institute of Medical Science,Hefei 230061,China

ObjectiveTo optimize the extraction technology of Pericarpium citri Reticulatae Viride with alcohol.Methods Compared the effect of different concentrations of alcohol on the extraction first,then studied the effective factors including the amount of alcohol of the suitable concentration,the extraction time and frequency with orthogonal test of L9(34),taking the extraction rate of total flavonoid determined by normalization method based on the standard hesperidin by HPLC as index.Results60% alcohol was selected as the extracting solvent and the extraction frequency had great influences on the index.ConclusionThe optimal extraction technology with alcohol was to extract Pericarpium citri Reticulatae Viride with 60% alcohol of 8 times the amount of medicinal material for 3 times and 1.0 hours each time.

Orthogonal test;Pericarpium Citri Reticulatae Viride;Extraction technology with alcohol;Hesperidin;Total flavonoid;HPLC

R284.2

B

2095-0616（2012）02-134-03

▲通訊作者

2011-12-09）