鹽酸小檗堿前體脂質體的制備及理化性質研究

楊 平 林珈好 王玉蓉

北京中醫藥大學中藥學院，北京100102

鹽酸小檗堿前體脂質體的制備及理化性質研究

楊 平 林珈好 王玉蓉▲

北京中醫藥大學中藥學院，北京100102

目的 制備鹽酸小檗堿前體脂質體，并對其理化性質進行考察。 方法 采用薄膜載體沉積法制備鹽酸小檗堿前體脂質體，正交實驗優選處方；透射電鏡觀察形態；馬爾文激光粒度儀測定粒徑；高效液相色譜法測定包封率。結果 電鏡下觀察脂質體形態多為圓形或橢圓形，平均粒徑為741 nm，包封率為 （29.93±1.32）%。 結論 該方法制備工藝簡單，易于工業化生產。

鹽酸小檗堿；前體脂質體；脂質體

小檗堿（berberine）又稱黃連素，常用于治療腸道炎癥。現代研究發現它對于心律失常、高血壓、高脂血癥、糖尿病和腫瘤等也具有較好的治療作用[1]。但由于鹽酸小檗堿口服血藥濃度低，維持時間短，難以達到有效的治療濃度，若長期大劑量給藥，又會產生諸多不良反應。1986年，英國學者Payne等[2]首次提出了前體脂質體（proliposomes）這一概念，是指將脂質材料吸附于水溶性載體上，制備成的干燥顆粒或粉末。當口服給藥時，與體液接觸，脂質溶脹而載體迅速溶解，在水相中形成脂質體，能促進藥物的吸收[3]。為解決鹽酸小檗堿吸收差及生物利用度低和普通脂質體不穩定等問題，本實驗首次探討了鹽酸小檗堿前體脂質體的制備工藝并對其理化性質進行研究。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT四元泵、CTO-10ASVP柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器）；752紫外可見分光光度計（上海現科分光儀器有限公司）； RE-2000A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）循環水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；pHS-3C精密酸度計（上海偉業儀器廠） ；BSl10S型1/萬電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；JEM-1230透射電子顯微鏡（日本電子公司）；Zetasize Nano ZS納米粒度儀（英國馬爾文）；Olympus CX21 型顯微鏡（日本）。

鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110713-200911）；鹽酸小檗堿提取物（四川什邡鴻鳴藥物原料有限公司）；Sephadex G-50 coarse（Pharmacia進口分裝）；Lipoid S75天然大豆磷脂（德國Lipoid公司，純度＞75%）；膽固醇（Amresco分裝）；麥芽糖糊精Maltrin M700（Grain Processing Corporation贈樣）；乙腈（色譜純）；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿前體脂質體的制備

2.1.1 制備方法 采用薄膜載體沉淀法制備：稱取處方量的磷脂、膽固醇及鹽酸小檗堿適量，溶于無水乙醇中，形成澄明溶液。另取適量麥芽糖糊精（載體）置100 mL圓底燒瓶中，于旋轉蒸發儀上快速轉動30 min（40～50℃）至呈流動態，分次向載體粉末中加入上述澄明溶液適量，旋轉蒸發至干。置真空干燥器中干燥過夜，即得鹽酸小檗堿前體脂質體，取出密閉于西林瓶中，置冰箱4℃保存，備用。取前體脂質體加適量蒸餾水水合，振搖混合均勻至呈無不溶性顆粒，即得脂質體混懸液。

2.1.2 正交設計實驗 通過大量預實驗，初步擬定了鹽酸小檗堿前體脂質體的制備工藝。為確定最優處方，以包封率為指標，以磷脂藥物比（A）、磷脂膽固醇比（B）、載體磷脂比（C）為考察因素，每個因素選擇3個水平，選用L9（34）正交表進行實驗。見表1。方差分析結果表明，3個因素對脂質體包封率的影響均不顯著。故依據極差分析結果，確定最優水平組合為A2B2C1，即磷脂/藥物為8︰1，磷脂/膽固醇為4︰1，載體/磷脂為2︰1。見表2、3。

表1 因素水平表

表2 正交實驗表

表3 方差分析表

2.1.3 驗證試驗 按篩選的處方和工藝制備前體脂質體，測得其包封率為（29.93±1.32）%。

2.2 鹽酸小檗堿前體脂質體包封率的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈 -0.033 mol/L KH2PO4（35∶ 65），用H3PO4調至pH3.2；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm，進樣 10 μL。

2.2.2 線性關系的考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10 mg，用甲醇溶解定容于50 mL量瓶中，得0.2 mg/mL對照品儲備液，精密量取儲備液適量，分別稀釋成 0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 的標準溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件測定。以峰面積（y）對樣品濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為：y=43 728x+382.68，R2=0.999 9，表明鹽酸小檗堿在0.2～8.0μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 精密量取鹽酸小檗堿對照品儲備液適量，用蒸餾水稀釋至濃度為2.0μg/mL的標準溶液。重復進樣5次，平均峰面積為885 14，RSD為0.41%。結果表明該方法精密度良好，符合要求。

2.2.4 回收率試驗 精密量取9份空白脂質體混懸液0.5 ～ 10 mL量瓶中，分別加入3個濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液，每個濃度3份，加入體積分數為 10% 的 Triton X-100乙醇溶液1 mL后，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得濃度為0.8、2.0、8.0 μg/mL的樣品溶液，按“2.2.1”項下測定，計算加樣回收率。低、中、高3種濃度的回收率分別為97.7%、98.2%和99.9%，RSD分別為1.92%、0.79%和0.19%（n=3），表明本方法回收率符合要求。2.2.5 包封率測定方法 取1.5g Sephadex G-50濕法裝于0.8 cm×20 cm層析柱，用 PBS緩沖液平衡。精密移取鹽酸小檗堿脂質體混懸液0.20 mL上樣，PBS洗脫，流速1.0 mL/min。收集前9 mL洗脫液為脂質體部分，后10～30 mL為游離藥物部分。游離部分用PBS緩沖液定容至25 mL量瓶中。按2.2.1項下方法測定鹽酸小檗堿含量，即為脂質體中未包封的游離藥物量。另取鹽酸小檗堿脂質體混懸液0.2 mL于25 mL量瓶中，操作同前，HPLC測定鹽酸小檗堿含量，此為總藥量，按公式計算包封率：包封率（EE%）=（1-W游/W總）×100%（注：W總為鹽酸小檗堿總藥量，W游為脂質體中未包封的游離藥物量）。

2.3 鹽酸小檗堿前體脂質體理化性質的研究

2.3.1 前體脂質體粉末的理化性質 外觀：前體鹽酸小檗堿脂質體為均一、流動性較好的黃色顆粒。休止角的測定：采用漏斗法測定。測得休止角均值為34.8°，均小于40°，表明流動性良好。

2.3.2 水合后脂質體的理化性質 光學顯微鏡觀察：吸取一滴水合后的脂質體混懸液至載玻片上，置光學顯微下觀察。結果顯示脂質體大小形態均一。見圖1。電子顯微鏡鏡觀察：取少量脂質體滴至載玻片上，用1%磷鎢酸進行負染，再滴至專用銅網上，自然揮干，使粒子在銅網上濃縮沉積，用電子顯微鏡觀察并拍攝照片。結果顯示脂質體形態多為圓形或橢圓形，明顯可見雙分子層結構。見圖2。脂質體粒徑的測定：取鹽酸小檗堿前體脂質體混懸液適量，用生理鹽水稀釋至適宜濃度，以動態光散射激光粒度電位測定儀測定脂質體的粒徑大小與分布，將樣品溶液加至四通比色皿的1.0 ～ 1.5 mL處，放入樣品測定池中。選擇測定參數，進行粒度測定，平均粒徑為741 nm，分散系數為0.214。見圖3。

圖1 鹽酸小檗堿脂質體顯微照片（40×10）

圖2 鹽酸小檗堿脂質體透射電鏡 照片（×200 00）

圖3 Zetasizer Nano ZS納米粒度儀測定結果

3 討論

本研究選擇載體沉淀法制備前體脂質體，曾考察山梨醇、甘露醇、葡萄糖、β-環糊精、氯化鈉、麥芽糖糊精作為載體，結果顯示采用麥芽糖糊精不僅外觀較好，且負載量較大，包封率也相對較高，故確定采用麥芽糖糊精為載體。

前體脂質體的制備方法一般對于脂溶性藥物包封率較高，可達90%以上，如尼莫地平為95%[4]，而對于水溶性和難溶性藥物包封率普遍較低，如鹽酸普奈洛爾前體脂質體水化后的包封率僅為10%[5]，利巴韋林為28%[6]，葛根素為43.53%[7]等。由于鹽酸小檗堿為強酸強堿鹽，水溶性脂溶性均不好，可能是導致包封率較低的主要原因。但是本研究首次嘗試將鹽酸小檗堿制成口服前體脂質體，成功解決了液體脂質體不穩定的問題，且制法簡便、適于工業化生產，為鹽酸小檗堿治療其他疾病拓寬了劑型研究途徑。鹽酸小檗堿前體脂質體動物體內的吸收和生物利用度研究正在進行中。

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Preparation of berberine hydrochloride prolipsomes and study of its physicochemical properties

YANG Ping LIN Jiahao WANG Yurong
School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China

ObjectiveTo prepare berberine hydrochloride proliposomes and investigate its physicochemical properties.MethodsProliposomes were prepared by film-deposition oncarriers. Orthogonal design was used to select the optimum formulation. The shape and particle size of proliposomes were investigated by transmission electron microscope and laser scatter. The encapsulation efficiency was determined by HPLC.ResultsThe berberine hydrochloride liposome vesicles were globular or elliptic under the electronic microscopy. The average size of the liposomes was 741nm. The encapsulation efficiency was(29.93±1.32)%.ConclusionThe preparation method is simple and easily industrialized preparation .

Berberine hydrochloride;Proliposomes;Liposomes

TQ43.2

B

2095-0616（2012）02-32-03

▲通訊作者

2011-11-25）