復方骨肽注射細菌內毒素的檢查方法研究

馮 磊

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

骨肽及復方骨肽注射液均具有刺激成骨細胞增殖、調節骨代謝、促進新骨形成等多種藥理作用，復方骨肽注射液是在骨肽注射液的基礎上，采用現代生物工程技術，與全蝎提取液制成的復方肽類制劑，含有多種骨生長因子，具有消炎止痛，促進骨愈合、生長等作用。臨床多用于骨折和骨科手術愈合及風濕、類風濕性關節炎、原發性骨質疏松等疾病的治療等[1-3]。本品現有的質量標準的控制采用熱原檢查法，本研究確定了復方骨肽注射液的內毒素檢查限值并研究其使用細菌內毒素檢查法的可行性，為其質量標準提高提供依據。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

細菌內毒素測定儀，型號BET-72（天津市天大天發科技有限公司）；鱟試劑（TAL，廈門鱟試劑實驗廠有限公司，批號:100420，規格1.7 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批號 :1010142，檢測范圍 =10.00 ～ 0.03 EU/mL，1.25 mL/支）；細菌內毒素檢查用水（BET水，中國食品藥品檢定研究院，內毒素含量＜0.005 EU/mL，規格:10 mL/支）；細菌內毒素國家標準品（NSE，中國食品藥品檢定研究院，批號:150600-200707，10 000 EU/支）；復方骨肽注射液（常州方圓制藥有限公司，規格：5 mL∶ 75 mg，批號：20110219A，20110219B，規格：2 mL∶30 mg，20110313A，20110104A；南京新百藥業有限公司，規格：5 mL∶75 mg，批號：110301，110302，規格：2 mL∶30 mg，批號：110105，110301。其他材料：漩渦振蕩器（scientific industries），試管，移液管，試管架。試管等玻璃器皿嚴格按照《中國藥典》2005年版二部附錄“細菌內毒素檢查法”中的相關要求經過浸泡、沖洗、干烤除細菌內毒素[4]。

1.2 方法

1.2.1 供試品細菌內毒素限值（L）的確定 根據公式：L=K/M，其中M為人用每公斤體重每小時最大劑量，依據藥品使用說明書，10 mL溶于生理鹽水后靜脈滴注，則M為10 mL/h；K為按規定的給藥途徑，臨床無任何不良反應的內毒素閾劑量，即人用每公斤體重每小時可最大接受的內毒素劑量，一般注射劑為5 EU/（kg·h），中國人平均體重按60 kg計。故中國人的內毒素閾計量為300 EU/h，由于該藥需要溶解在生理鹽水內靜脈滴注，計算時應考慮生理鹽水所占的內毒素量，生理鹽水的內毒素限值為0.5 EU/mL，滴注速度一般不超過250 mL/h，代入公式計算復方骨肽注射內毒素限值。

1.2.2 標準曲線的可靠性試驗 標準曲線系列溶液的制備：用細菌內毒素檢查用水將內毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL。陰性對照：使用的內毒素檢查用水即為陰性對照液。各取0.1mL分別加到預先加有0.1 mLTAL試劑反應管內，混合均勻，立即插入BET-72細菌內毒素測定儀內進行自動檢測，其中每一個濃度重復3管，每個批號的鱟試劑進行一次可靠性試驗。

1.2.3 樣品最大有效稀釋倍數（MVD）計算[1]公式為：MVD=L·C·λ-1。L為復方骨肽注射液內毒素限值，即L=17.5 EU/mL；C為1.0 mL/mL；λ為標準曲線的最低內毒素濃度0.031 25 EU/mL；計算得復方骨肽注射液MVD。

1.2.4 干擾試驗預實驗 樣品系列溶液的制備：復方骨肽注射液用內毒素檢查用水依次稀釋為 35、70、140、280、560倍溶液，記為Ai液。樣品陽性對照溶液制備：將復方骨肽注射液用內毒素檢查用水依次稀釋為含有標準內毒素λm=0.1 EU/mL的35、70、140、280、560倍樣品溶液，作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為Bi液。標準曲線系列溶液的制備：用細菌內毒素檢查用水將內毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/mL 稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL記為C液。陰性對照：使用的內毒素檢查用水即為陰性對照液，記為D液。分別取上述各液0.1 mL，加入預先加有0.1 mL TAL試劑的反應管內，混勻立即插入BET-72細菌內毒素測定儀內進行檢測，其中每一個濃度重復2管，用C液結果進行線性擬合，計算回收率。回收率（%）=（Bi液內毒素值-Ai液內毒素值）×λm×100%。每個生產廠家選取一批，并用每個批號的鱟試劑進行一次干擾試驗。

1.2.5 干擾試驗 選取70倍稀釋進行干擾試驗。樣品系列溶液的制備：復方骨肽注射液用內毒素檢查用水依次稀釋為70倍溶液，記為Ai液。樣品陽性對照溶液制備：將復方骨肽注射液用內毒素檢查用水依次稀釋為含有標準內毒素λm=0.1 EU/mL的70倍樣品溶液，作為樣品添加內毒素陽性對照管，記為Bi液。標準曲線系列溶液的制備：用細菌內毒素檢查用水將內毒素國家標準品進行10 ～ 2倍稀釋，最終細菌內毒素濃度分別為 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU/mL 稀釋系列，即λ=0.031 25 EU/mL記為C液。陰性對照：使用的內毒素檢查用水即為陰性對照液，記為D液。分別取上述各液 0.1 mL，加入預先加有0.1 mLTAL試劑的反應管內，混勻立即插入BET-72細菌內毒素測定儀內進行檢測，其中每一個濃度重復2管，用C液結果進行線性擬合，計算回收率。

2 結果

2.1 復方骨肽注射的限值

經過計算確定為17.5 EU/mL。

2.2 標準曲線的可靠性試驗

標準曲線的可靠性試驗符合規定。見表1。

表1 標準曲線的可靠性實驗結果（n=3）

2.3 液最大有效稀釋倍數（MVD）

計算結果為560倍。

2.4 干擾試驗預試驗

標準曲線:安度斯鱟試劑批號1010142，lgT=3.008 78–0.360 42 lgC，r=-0.994 0。陰性對照結果符合規定。廈門鱟試劑批號 100420，lgT=2.778 62–0.291 52lgC，r=-0.997 0。陰性對照結果符合規定。

樣品的添加內毒素平均回收率均在50%～200%范圍內，符合《中國藥典》2010年版規定，初步表明樣品的5個濃度溶液均對內毒素與鱟試劑的反應無干擾影響。見表2。

表2 方骨肽注射液的干擾試驗預實驗回收率試驗結果（%，n=2）

2.5 干擾試驗

標準曲線:安度斯鱟試劑批號1010142，lgT=3.02120–0.312 56 lgC，r=-0.99 22。陰性對照結果符合規定。廈門鱟試劑批號 100420，lgT=2.671 20–0.296 47 lgC，r=-0.998 5。陰性對照結果符合規定。兩個生產廠家的8批復方骨肽注射液的回收率均在50%～200%范圍內。見表3。

表3 復方骨肽注射液的干擾試驗預實驗回收率試驗結果（n=2）

2.6 結論

復方骨肽注射液在該實驗條件下對2個廠家的鱟試劑不存在干擾作用，該品種可以使用動態濁度法進行細菌內毒素測定。

3 討論

細菌內毒素檢查法與用傳統的家兔法檢測熱原物質相比，操作簡單，影響因素少，不使用動物試驗，更符合3R（減少、優化、替代）的動物福利原則。并且不需建立動物房即可進行實驗，對細菌內毒素的靈敏度大大高于家兔法且具有非常好的重復性。在世界各國藥典中內毒素檢查法已成為熱原物質檢查的重要方法。復方骨肽注射液關于內毒素檢查法的干擾試驗結果表明，復方骨肽注射液對內毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，可以用于日常檢驗和質量控制。本實驗的8批次復方骨肽注射液內毒素含量均小于4.375 EU/mL。低于限值17.5 EU/mL內毒素含量符合規定。

細菌內毒素檢查法分為凝膠法和光度測定法兩大類共計6種檢查法，實際檢驗時，除另有規定外，可使用任意一種方法進行檢測。凝膠法為限量和半定量檢查，而光度測定法為定量測定。在我國目前應用最為廣泛的是凝膠法，但凝膠法由于其本身為定性試驗，不能直觀量化回收率，因此干擾試驗操作復雜，人工成本和材料成本都較高，并且無法對與鱟試劑反應產生陽性的樣品進行干擾試驗的研究，具有很大的局限性。因此本研究采取了在我國光度測定法中應用最為廣泛的動態濁度法，其在干擾試驗方面更為科學和準確。而通過本實驗確定了復方骨肽注射液可以應用于動態濁度法，由于濁度法與凝膠法擁有相同的反應機制，都是通過內毒素與鱟試劑中的酶反應產生凝聚同時發生濁度變化，所以本實驗的結論對于凝膠檢查法的適用性仍有參考價值。通過本研究驗證了動態濁度法在品種建立、家兔熱原檢查法轉換細菌內毒素檢查法中的突出優越性。

[1]段景柱，崔少千.復方骨肽注射液促進四肢骨折愈合的臨床觀察[J].實用藥物與臨床，2006，9（3）：169-170.

[2]趙剛，張士坤.應用復方骨肽注射液治療原發性骨質疏松癥的臨床觀察[J].中國醫院藥學雜志，2009，29（6）：478-479.

[3]鄧利娟，任雪，范慧紅.骨肽及復方骨肽注射液降壓物質的研究[J].中國生化藥物雜志，2010，31（4）:231-232.

[4]國家藥典委員會.中國藥典（2010年版）.第3部.北京：中國醫藥科技出版社，附錄XIIE，附錄95-98.