結(jié)核分枝桿菌Ag85A／MPT-64融合基因DNA疫苗的構(gòu)建及免疫研究中ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用

張 娟，蔣 俊，張 紅，馬龍鳳，包 洪，于 庭＊

（1.沈陽市胸科醫(yī)院，遼寧 沈陽110000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041）

近年來，隨著耐藥、耐多藥結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的出現(xiàn)，使結(jié)核病死灰復(fù)燃，成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會問題，也因此使得結(jié)核病新型疫苗以及新型診斷試劑的研究具有重要意義。

多年來，人們一直將結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白（culture filtrate proteins CFP）作為結(jié)核病預(yù)防和診斷試劑的抗原成分進行研究［1，2］。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，Ag85復(fù)合物是MTB的主要分泌性蛋白抗原，占分泌蛋白總量的30%。而MPT64蛋白，是存在于MTB早期培養(yǎng)濾液中的一種主要分泌蛋白，占總量的8%，具有超氧化物歧化酶的活性［3］，并具有較強的細胞免疫活性，特異性強于純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin，PPD）。

我們根據(jù)Ag85蛋白和MPT64蛋白的特點，構(gòu)建了Ag85A／MTP64核酸疫苗，通過真核表達，獲得大量純化的蛋白，并通過酶聯(lián)免疫斑點（Enzymelinked Immunospot Assay，ELISPOT）技術(shù)對研究結(jié)果進行了驗證，為進一步研究核酸疫苗在預(yù)防結(jié)核病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料PCR系統(tǒng)含pfu Taq DNA聚合酶，dNTPs，buffer，MgCl2等購自上海生工公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、BioLabs T4DNA連接酶試劑盒、DNA Marker購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)品純化試劑盒購自O(shè)mega公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海華瞬生物有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒、酵母提取物、胰化蛋白胨購自上海生工公司；瓊脂糖購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核桿菌基因組DNA的提取 取少量結(jié)核菌H37Rv液接種于7H9液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)兩周。取3ml液體培養(yǎng)物12 000r·min－1離心1min，將沉淀重懸于50μl裂解液（10×PCR緩沖液5μl、45g·L－1吐溫－20 5μl、45g·L－1NP-40 5μl、20g·L－1蛋白酶 K0.5μl及水34.5μl）中，55℃水浴1h，沸水浴10min滅活蛋白酶K，12 000 r·min－1離心1min。取上清，先酚／氯仿／異戊醇抽提2次，再酚／氯仿抽提2次，預(yù)冷無水乙醇沉淀，－80℃冰凍10min。溶于50μl TE中，貯于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Ag85A、MPT-64的擴增引物由英駿公司合成，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌H37Rv Ag85A、MPT-64基因編碼序列共設(shè)計4條引物，分別為：

P1mpt6 上 游 引 物 5′-GGAATTCCATGGTGCGCATCAAGATCTT-3′含 EcoRⅠ酶切位點和ATG起始密碼子。

P2mpt6 下 游 引 物 5′-GGA TCC CTA GGC CAG CAT CGA GTC-3′含 BamHⅠ酶切位點和TGA終止密碼子。

P3ag85a 上 游 引 物 5′-AGGATCCATGTTTTCCCGGCCGGGCTTG-3′，含BamHⅠ酶切位點和起始碼ATG。

P4ag85a下游引物 5′-GGAATTCCTATGTTCGGAGCTA GGCGCCCTGGG-3′，含 EcoRⅠ酶切位點和終止碼。

PCR反應(yīng)體系：10×buffer 5μl、dNTPs 1μl（2.5mmol·L－1）、DNA 2μl，P1、P2引物各0.5μl（50μmol·L－1）及 Taq酶0.5μl（2U），加水至50 μl。反應(yīng)條件為：95℃變性5min，然后95℃45s，60℃30s，72℃60s，共32個循環(huán)，再72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。P3和P4的反應(yīng)體系及條件同上。

1.2.3 構(gòu)建和鑒定Ag85A／MPT-64重組質(zhì)粒 取雙酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）和PCR產(chǎn)物各6μl，10×T4DNA連接酶緩沖液2μl、T4DNA連接酶2 μl，加水至20μl，22℃過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于2YT平板（含氨芐青霉素100mg／L），藍白法篩選陽性克隆。隨機挑選白色菌落，分別接種于4ml含氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，堿裂解法提質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和EcoRI雙酶切，進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無約978bp大小的Ag85A片段，約738bp大小的MPT-64片段。并對陽性克隆進行測序。

1.2.4 構(gòu)建 Ag85A／MPT-64真核表達載體 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切陽性克隆重組質(zhì)粒Ag85A／MPT-64后，進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收1 716bp大小的酶切產(chǎn)物，溶于35μl H2O中，貯于－40℃?zhèn)溆谩Ｍ瑯犹崛≌婧吮磉_載體質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖膠回收試劑盒回收，35μl H2O回溶，貯于－40℃?zhèn)溆谩Ｈ‰p酶切后的質(zhì)粒和DNA各3μl，10×T4DNA連接酶緩沖液2μl，T4DNA連接酶2μl，加水至20μl，22℃過夜，然后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，涂布于2YT平板（含氨芐青霉素100mg·L－1），藍白斑法篩選陽性克隆。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。

1.2.5 Ag85A／MPT-64DNA 疫苗的制備及其動物免疫 大量培養(yǎng)含Ag85A／MPT-64的BL21菌株后提取質(zhì)粒，酚：氯仿：異戊醇法純化質(zhì)粒［4］。用無菌生理鹽水把其濃度稀釋為1.5g／L。為進行預(yù)處理，用8.5g／L比卡因60μl肌注8只BALB／c小鼠大腿每側(cè)，3周后再各肌注Ag85A／MPT-64 60 μl。按同樣方式，分別用空白質(zhì)粒和滅菌生理鹽水各免疫8只BALB／c小鼠作為空白對照和陰性對照。

1.2.6 ELISPOT方法檢測疫苗免疫原性 免疫3周后的小鼠剪尾取血分離血清，用ELISPOT方法檢測定血清中Ag85A／MPT-64抗體的滴度。酶標板用結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白包被，60μl／孔，4℃過夜。1%小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma公司）37℃封閉45min，不同稀釋度的待檢血清經(jīng)稀釋后加入，辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，鄰苯二胺底物顯色后，在波長490nm處測吸光度值（A）。實驗組A值≥3.2為陽性（以正常鼠血清作陰性對照，吸光度值0.0以上）。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌Ag85A／MPT-64基因的克隆及序列分析

模板為結(jié)核桿菌H37Rv的基因組DNA，PCR經(jīng)32個循環(huán)后擴增出特異性條帶。將擴增產(chǎn)物雙酶切后與質(zhì)粒連接再轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞。隨機挑選白色菌落提質(zhì)粒，雙酶切后，可見約978bp大小的Ag85A片段，約738bp大小的MPT-64片段，命名為Ag85A／MPT-64。雙向測序所得序列結(jié)果與報道一致［5］（圖1A）。

2.2 構(gòu)建Ag85A／MPT-64的真核表達載體

擴大培養(yǎng)陽性克隆后提取質(zhì)粒DNA，雙酶切后回收約1 716bp大小的酶切產(chǎn)物，與用同樣酶切但經(jīng)瓊脂糖膠切膠回收的質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。在轉(zhuǎn)化后的平板上隨機挑選所需克隆提質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ單酶切出約1 716bp大小的片段，經(jīng)雙酶切出約978bp和738bp大小的兩個片段（圖1B）。

2.3 DNA疫苗的ELISPOT檢測

測定免疫后的各組小鼠血清中抗Ag85A／MPT-64抗體的水平，免疫鼠血清Ag85A／MPT-64抗體全部為陽性，生理鹽水陰性對照組和質(zhì)粒空白對照組的小鼠血清Ag85A／MPT-64抗體全部為陰性，幾何平均滴度經(jīng)ELISPOT方法檢測為1∶1 700（圖2）。如Bastos等［11］所述，通過ELISPOT可以篩選出有效的激發(fā)機體免疫球蛋白（immunoglobulin Ig）產(chǎn)生和CK產(chǎn)生的疫苗，對于疫苗的研究具有重要意義。此外，通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)，或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，進行高通量篩選，效率遠遠高于其他檢測方法［12］。

圖1 瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物及載體酶切位點

圖2 ELISPOT檢測DNA疫苗的顯色反應(yīng)

3 討論

4，400kb的結(jié)核分枝桿菌片段含有4000多基因。它們表達的蛋白能夠引起較強的細胞和體液免疫反應(yīng)，因此此類基因被作為篩選DNA疫苗的侯選基因，包括 HSP、MPT-64、Ag85、Esat-6、PstS-3等［6］。

由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個成分組成的Ag85復(fù)合物，其相對分子質(zhì)量約為30×103－32×103，在結(jié)核桿菌和BCG的細胞壁和培養(yǎng)濾液中大量存在，Ag85的分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶活性在結(jié)核桿菌細胞壁的合成后期具有重要作用。Ag85A、Ag85B、Ag85C三個成分具有高度的同源性，并且Ag85的含量在結(jié)核桿菌的細胞壁蛋白和分泌蛋白中較高，約占總蛋白的31%－45%［7］。Ag85／MPT-64蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生大量的INFγ和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的T細胞增殖，同樣經(jīng)Ag85／MPT-64免疫的小鼠能夠抵抗結(jié)核桿菌的攻擊。據(jù)報道人感染結(jié)核桿菌后的血清中也可以測到較高含量的Ag85／MPT-64抗體。

有研究分析表明抗原替代型卡介苗是具有可行性的。卡介苗進入膀胱后結(jié)合在腫瘤細胞表面的纖維連接蛋白（FN）或膀胱上皮細胞上，引起免疫反應(yīng)。這種結(jié)合是因Ag85具有與FN結(jié)合的特性，被稱為纖連蛋白結(jié)合抗原［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)［8］，灌注卡介苗后Ag85進入體內(nèi)可以激活能夠識別Ag85的記憶細胞（這些記憶細胞可能在體內(nèi)已經(jīng)存在），產(chǎn)生免疫反應(yīng)。本實驗已經(jīng)成功地構(gòu)建了Ag85A／MPT-64核酸疫苗，并初步證實動物免疫之后能夠產(chǎn)生抵御結(jié)核桿菌侵襲的特異性抗體［9］，為進一步研究核酸疫苗在預(yù)防結(jié)核病和防治膀胱癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

實驗證明ELISPOT試驗比TST有更好的特異性和敏感性，這種方法有助于篩查和監(jiān)測接受抗腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor TNF）治療病人的結(jié)核感染情況［10］。也有實驗表明，診斷HIV人群潛伏性結(jié)核病感染（LTBI）使用結(jié)核菌特異性抗原的IFN-γ試驗也是有效的。許多研究已證實ELISPOT及其高敏感性和特異性在結(jié)核病人的篩查中具有重要的作用，作為一個結(jié)核病高發(fā)、BCG接種較普及的國家，應(yīng)用此技術(shù)對有結(jié)核病接觸史的人群進行普查，會排除TST、PPD假陽性、假陰性的影響，及早發(fā)現(xiàn)結(jié)核病潛在感染者，結(jié)合其反應(yīng)程度，必要時進行預(yù)防性治療，無疑會降低發(fā)病率，減少傳染源。

我國結(jié)核病發(fā)生率非常高，且普遍接種BCG，這使傳統(tǒng)的TST試驗診斷結(jié)果的準確性受到很大影響，而研究證實不受BCG影響的ELISPOT試驗技術(shù)由于有著更強的特異性，因而更有研究意義，開展ELISPOT技術(shù)來完善結(jié)核的診斷方法也更有發(fā)展前景。研究證明ELISPOT技術(shù)能發(fā)現(xiàn)早期的結(jié)核感染，且比TST有更好的特異性和敏感性，這種方法有助于臨床醫(yī)師進行篩查和監(jiān)測結(jié)核感染，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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