苦參堿對小鼠坐骨神經損傷后脊髓運動神經元的影響

曹 劍，王永安，魏 壯，劉浩宇，尹維田

（1.赤峰市醫院，內蒙古 赤峰024000；2.吉林大學中日聯誼醫院）

本文對坐骨神經損傷BALB／c小鼠應用苦參堿，通過對坐骨神經相應脊髓節段gap-43的測定和神經LFB染色的觀察，探討苦參堿對周圍神經損傷后的修復和再生方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康成年雄性BALB／c小鼠160只（體重25±2g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供）單側坐骨神經離斷后，常溫飼養，普通飲食，自由飲水。隨機分為生理鹽水空白對照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組和低劑量給藥組，其中實驗組動物又根據術后存活時間隨機分為12h，24h，3d，5d、7d、2 w，4w，8w組，以上各組每組10只動物。

1.2 動物模型制備

坐骨神經損傷模型的制作：BALB／c小鼠經1%硫噴妥鈉100mg／kg腹腔麻醉，俯臥位固定，無菌條件下單側下肢股后部縱切口約2cm，梨狀肌下暴露坐骨神經，用玻璃分針鈍性小心分離坐骨神經主干和周圍組織，在坐骨結節下0.5cm處完全離斷坐骨神經，以11／0顯微縫線12倍顯微鏡下吻合坐骨神經，分層縫合肌肉和皮膚。

1.3 給藥方法和劑量

采取灌胃方法給藥。參照臨床應用苦參堿原藥劑量，等效換算為腹腔注射用劑量［1］，將此數值作為給藥的中等劑量，并以等比數列量確定高低劑量組用量。最終各組給藥量為，高劑量組10mg／kg／d，中劑量組5mg／kg／d，低劑量組2.5mg／kg／d，取相應劑苦參堿以生理鹽水溶解后腹腔注射。對照組給予同等體積生理鹽水。連續給藥至處死。

1.5 取材及標本制備

取每組動物5只分別在相應的時間點用1%硫噴妥鈉100mg／kg腹腔麻醉后，采用脊柱后方正中切口咬骨鉗咬開椎管，切取損傷側L4－L6段的脊髓，標記后迅速浸置于液氮中備用。

取每組另外5只在相應時間點切取坐骨神經自吻合口（包括吻合口在內）向遠端0.6－0.7cm神經干，10%中性甲醛固定標本72小時以上，經酒精逐級脫水后石蠟包埋。

1.6 檢測方法

1.6.1 Real-time PCR 法檢測 首先進行引物的合成，用 Beacon designer 7軟件設計 gap-43、以GAPDH為引物（表1），經檢索Blast驗證特異性。分別取各時間點的L4－6脊髓節段組織，采用Trizol試劑提取總RNA，以提取的總RNA為模板進行反轉錄制備cDNA庫。以cDNA庫為模板，PCR擴增L4－6脊髓節段組織的gap-43，每個反應體系中均加入GAPDH的一對引物作為PCR擴增的內參，反應條件：95℃30s－58℃60s－72℃60s40個循環。

1.6.2 髓鞘固蘭染色 切取坐骨神經自吻合口（包括吻合口在內）向遠端0.6－0.7cm神經干，10%中性甲醛固定標本72小時以上，經酒精逐級脫水后石蠟包埋，制片行HE染色。觀察神經的基本結構及有無細胞增生、炎細胞浸潤等改變，初步篩選特染對象。切片脫蠟后，用LFB液60℃浸泡12小時；95%酒精浸泡5min；加入0.05%碳酸鋰15s；而后70%酒精洗滌完畢蒸餾水洗滌，脫水透明封片。

表1 Beacon designer 7軟件設計GAP43、GAPDH引物

2 結果

2.1 Realtime-PCR分析結果

Gap-43mRNA在正常大鼠坐骨神經組織少量表達，當坐骨神經損傷后，相應脊髓節段組織gap－43mRNA的含量上升，從損傷后12h開始到5d呈現逐漸增加的趨勢，各組間差異性明顯，其中高中劑量組的增多量明顯低于低劑量和對照組。見圖1。2w后gap-43在高中劑量組呈持續表達。其中，中劑量組明顯促進了gap-43的表達。

圖1 各時間點gap-43的mRNA表達

2.2 LFB染色結果

LFB染色后，髓鞘呈天藍色，軸突不著色，背景為白色。術后8周染色結果見圖2。高、中劑量組髓鞘形狀規則，厚度較為均一，輪廓明顯且周邊纖維組織增生不明顯；低劑量組髓鞘形狀及厚度較不規則，但輪廓尚明顯，束間可見纖維結締組織增生；對照組鞘形狀更加不規則，纖維結締組織增生明顯。

圖2 造模后各劑量組髓鞘固藍染色結果

綜合以上兩組指標的檢測，不同時相小鼠L4－6脊髓節段組織中gap-43mRNA的變化，以及髓鞘LFB染色的趨勢具有一致性。

3 討論

苦參堿是廣泛存在于豆科植物苦參（sophora flavescents Ait）、苦豆子（S.alopecuroides L）及廣豆根（S.subprostrate chunet T.Chenk）等中草藥中的有效成份。近年來對苦參堿的研究較為廣泛，它的化學式為C15H24N20，屬于四環的喹嗪啶類，分子骨架可看作2個喹嗪啶環的雜體。苦參堿具有多種藥理作用，對中樞神經系統可引發中樞神經麻痹，可防治腦水腫和鎮靜、降溫作用；對心血管系統，可增強心肌收縮力，抗心律失常、抗動脈粥樣硬化；對消化系統，可防治肝炎、抗肝纖維化，利膽、止瀉，保護胃腸黏膜；對呼吸系統，具有祛痰平喘作用。此外，還有抗病毒、抗寄生蟲、抗炎、免疫調節及抗瘢痕形成等作用［2－4］。而對其促進神經損傷后修復的研究較少。生長相關蛋白gap-43是一種胞膜磷酸蛋白質，是膜快速轉運蛋白，與神經元生長發育、突觸形成及神經可塑性密切相關［5］。在膜信號轉導系統中，G蛋白作為信號轉導因子和放大器處于核心地位，gap-43可調控G蛋白［6］。這種作用是通過gap－43的可結合到膜內表面的氨基末端完成的，作為純化的蛋白質，gap-43起一個鳥苷酸釋放蛋白的作用。它可提高從G0蛋白釋放GDP、提高GTP激酶活性及與GTP的結合［7］。我們的研究發現：Realtime PCR的檢驗結果表明坐骨神經損傷后，相應脊髓節段的gap-43被激活并大量表達，應用苦參堿后高中劑量組的gap-43表達明顯高于低劑量組及對照組，并與2周后持續表達。坐骨神經損傷后應用苦參堿可以對gap-43的活化起到持續促進作用，促進了神經的再生。

［1］de Oliveira Luiz FC，Edwards Howell GM，Velozo Eudes S，Nesbitt M.Vibrational spectroscopic study of brazilin and brazilein，the main constituents of brazilwood from Brazil［J］.Vib Spectrosc，2002，28：243.

［2］Kim JK.Illustrated natural drugs encyclopedia［M］.Seoul；Namsandang Publishers；1989：79.

［3］黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9（9）：1069.

［4］劉 梅，劉雪英，程建峰.苦參堿的藥理進展［J］.中國中藥雜志，2003，28（9）：801.

［5］Benowitz L I，Routtenberg A.GAP-43：an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity［J］.Trends Neurosci，1997，20 （2）：84.

［6］Fishman MC.GAP243：Putting constraints on neuronal plasticity［J］.Perspective in developmental neurobiology，1996，4：193.

［7］Dani JW，Armstrong DM，Benowitz L I.Mapping the development of the rat brain by GAP-43Immunocytochemistry［J］.Neuroscience，1991，40（1）：277.