氯離子通道ClC－2在非小細胞肺癌中的表達及意義

許哲男，鄭向宇，趙 維，辛 華，韓振國＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院 胸外科，吉林 長春130033；2.吉林大學白求恩醫學院 病理生理教研室）

氯通道是分布于細胞膜上對氯離子或其他陰離子有通透性的電壓門控氯通道（voltage－gated Cl channel，ClC），哺乳動物共有9個亞型，廣泛存在于機體的細胞膜和細胞器膜，參與細胞的多種活動和功能調節過程。研究發現多種腫瘤組織中都存在ClC－2蛋白的過度表達和處于磷酸化狀態。本研究以非小細胞肺癌為研究對象，與正常肺組織作為對比，探討氯離子同通道ClC－2在非小細胞肺癌及肺部疾病中表達情況，亦探明氯離子通道ClC－2作為治療非小細胞肺癌的基因靶位提供有利的依據，為治療該腫瘤提供新的理論根據及途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 實驗分組 正常肺組織為對照組，肺鱗癌、肺腺癌、肺良性病灶為實驗組。肺良性病灶以肺結核為主，部分為肺大泡和炎性假瘤。組織標本購于吉林大學組織標本庫，均收集于吉林大學中日聯誼醫院胸外科2008.05－2009.08經手術切除后保存的新鮮冷凍組織，提供標本的患者術前未經放、化療等系統抗癌治療。

1.1.2 試劑 總RNA提取Trizol試劑盒購于Invitrogen公司，PCR試劑購自TaKara公司。反轉錄試劑盒，核酸分子量標準品，Taq酶，人ClC－2抗體（購自美國Santa Cruz公司）為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的人抗體為二抗，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，M－MuLV RT、5XBuffer，M－MuLV RT Oligo d（T）Primers、購自（寶生物，日本），免疫組化超敏Ultrasensitive S－P試劑盒和DAB顯示試劑盒（福州邁新公司），所有抗體均為即用型。

1.1.3 設備 低溫高速離心機（久保田，日本），722分光光度計（上海儀器廠），PCR儀（TAKARA，日本），全自動數碼凝膠成像分析系統（Tanon，中國），電泳儀（Bio－rad，美國），蛋白質電泳裝置及轉移系統（BioBrad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 檢測ClC－2mRNA的表達 應用Trizol試劑盒，按照試劑盒使用說明書對肺鱗癌及腺癌；肺良性病灶，正常肺組織分別提取總RNA。以上述所得總RNA為模板、Oligo（dT）為mRNA引物，應用SuperScriptⅡ試劑盒逆轉錄合成cDNA，以此為模板，用人ClC－2特異性引物對cDNA進行PCR特意擴增，詳細操作步驟參見說明書。ClC－2引物序列

forward5′－AGGCTTCTGTCTGCTTCCA－3′；Reverse5′－TTCCAATGAGTCTGCCAATAC－3′。擴增的產物cDNA3′端大小約477bp。獲得RTPCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗，用以上的方法檢測實驗組和對照組。

1.2.2 Western blot檢測ClC－2蛋白的表達 按試劑盒說明書操作。采用凝膠成像系統攝像，軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 RT－PCR

利用ClC－2特意引物對逆轉錄成cDNA進行PCR擴增，結果顯示在與DL2000DNA marker對應的250－500bp之間非小細胞肺癌組有一明顯特異片段，肺良性病和正常肺組中其顯示微弱，再與每個樣品測得的目的基因含量與本樣品的GAPDH含量相除，得到每個樣品目的基因的相對含量，然后才進行樣品與樣品之間的比較。結果表明非小細胞肺癌ClC－2基因表達量明顯增加（見圖1）。

圖1 RT－PCR檢測ClC－2及GAPDH的電泳結果

2.2 Western Blot

檢測結果顯示非小細胞肺癌組中ClC－2蛋白在98KD出有一條明顯特征帶，ClC－2／β－Actin趨勢比較，表明非小細胞肺癌中鱗癌表達量最高，其次肺腺癌及良性病灶表達無明顯差距，相比正常肺組織中ClC－2蛋白表達量比實驗組降低，每組中氯離子通道ClC－2均有一定的表達（見圖2）。

圖2 Westemblot檢測ClC－2蛋白的表達

3 討論

ClC屬電壓門控性通道（voltage－gated chloride channels，ClC），在細胞的容積調節、細胞電位、細胞器的酸化及pH的調節、細胞的增殖、分化及凋亡，免疫細胞的募集及激活等多種病理生理過程中發揮重要作用［1，2］，近年來研究發現電壓門控性氯離子通道在多種腫瘤細胞中表達異常，且可能在腫瘤細胞的發生、演化、增殖、細胞周期、侵襲轉移及耐藥性等惡性生物學行為中可能起重要作用［3，4］。

ClC－2是ClC的一員，其分布廣泛，在大腦，腎臟及腸道的表達相對較高［5］。ClC通道家族成員的蛋白質功能性結構分析表明［6］，ClC通道蛋白質可能形成二聚體，具有“雙筒槍（double－b－arreled）”通道結構。基因突變所造成ClC型氯離子通道蛋白質的結構異常，尤其是涉及功能的活性位點發生變化，是影響ClC型氯離子通道生理功能并發疾病的一個主要原因，例如CBS區域內（真核生物ClC蛋白中還有兩個β－胱硫醚合酶）的點突變會影響通道的電壓依賴性及ATP結合，導致一些遺傳性疾病［7，8］，另外ClC型氯離子通道的基因缺陷或表達異常也會引起相應的生理變化或疾病。

電壓門控性氯離子通道影響生物學行為的機制可能如下：（1）調節細胞內鈣離子濃度，運用氯離子通道阻滯劑作用癌細胞后，細胞增殖能力降低，細胞周期停滯于G0／G1，同時細胞內鈣離子濃度下降，這可能表明氯離子通道調節鈣離子濃度，從而間接影響癌細胞的增殖和細胞周期［9］。（2）磷酸化調節cAMP依賴的激酶（PKA）和蛋白激酶C（PKC），可以刺激或抑制ClC－2的活性，活體外的磷酸化測定顯示ClC－2可以被M時相特異同期蛋白依賴性激酶p34cdc2／細胞周期調節蛋白B（M－phase－specificcyclin－dependent kinase p34cdc2／cyclinB）磷 酸化［10］，顯著降低 ClC－2電流。因此 ClC－2第632位絲氨酸－丙氨酸（S632A）突變消除了ClC－2的磷酸化位點，從而消除了p34cdc2／cyclinB對其功能的調節作用。（3）細胞體積調控機制，當細胞處在一個低滲環境時，水的被動流動引起細胞腫脹后水和離子外流，細胞的體積得以恢復，此過程稱為細胞調節性體積下降（regulatory volume decrease，RVD），癌細胞在侵襲遷移過程中需要體積下降以“擠”過狹小的組織間隙。調節性細胞容積回縮（RVD），認為是當細胞暴露與低滲環境時，細胞膨脹，該膨脹會激活細胞的調節機制，使已增大的細胞容積減小并向正常體積轉變。RVD被認為是細胞增殖、分化、遷移及細胞的凋亡密切相關的生理功能之一。研究發現鼻咽癌發生中，氯通道通過RVD參與了細胞增殖、侵襲及轉移［11，12］。Soroceanu等分別證實，氯通道阻斷劑能夠抑制腫瘤的侵襲。腫瘤侵襲轉移是一個序貫，復雜的過程，包括腫瘤細胞脫離原發灶、黏附基底膜和細胞基質，并對其水解破壞，癌細胞侵入周圍脈管，繼續生長形成轉移癌，貫穿于整個過程，肺癌細胞的浸潤可視為一個“主動”運動過程，通過癌細胞容積和形狀的改變，具有浸潤潛能的癌細胞來完成浸潤及轉移。有研究證實低滲環境下，腺癌細胞可實現容積的部分恢復，而鱗癌細胞可調節細胞回復原有的或甚至更小的容積，表明與正常肺組織相比，肺癌細胞具有較強的機制來控制細胞大小以保持其旺盛的生存能力，進而使細胞發生快速變形以增加其分裂增殖及浸潤潛能。

本實驗采用RT－PCR法和 Western blot法分別在基因和蛋白水平檢測非小細胞肺癌、肺良性病及正常肺組織中ClC－2mRNA及ClC－2通道蛋白的表達程度，結果顯示ClC－2基因產物為非小細胞肺癌中表達量明顯高于肺良性病及正常肺組織，提示ClC－2可能與肺癌癌變的原始發生和進展過程中起到基因調控作用，與腫瘤發生、促進增長及浸潤轉移有關。ClC－2mRNA特異性表達升高在基因水平上賦予了肺癌細胞較強的氯離子轉運能力，有利于細胞大小和形狀的改變，從而導致瘤細胞易于分裂和侵襲轉移。然而蛋白表達水平上肺良、惡性腫瘤與正常肺組織相比有明顯表達增加，但良、惡性疾病之間無顯著差異。這可能提示氯通道作為電壓門控離子通道，廣泛分布于人體的細胞器及細胞器膜，調節細胞體積。在肺部疾病發展過程中正常細胞向疾病轉變，一系列遺傳信息的改變可能會影響ClC－2蛋白的表達，或ClC－2蛋白的活性發生改變，從而導致無論是非小細胞肺癌，還是肺良性疾病，均會增加ClC－2蛋白表達量。

但ClC－2mNRA及ClC－2蛋白在正常組織和肺部良、惡性疾病中的表達差異及發生變異的ClC－2離子通道基因作用于肺惡性腫瘤生成，進展的哪個階段等一系列問題必將會今后研究的重要方向。ClC－2也將成為非小細胞肺癌及肺部疾病診的斷與治療提供新的基因靶位，對此，還需要進一步研究。

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