社區相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的同源性及PVL毒素研究

潘宏升，荀鳳嬌，田素飛，年 華，褚云卓＊

（1.中國醫科大學附屬第一醫院 檢驗科，遼寧 沈陽110001；2.遼寧省第三人民醫院 檢驗科）

目前，全球范圍內由社區相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趨勢，CA－MRSA與醫院相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（HA－MRSA）存在許多不同，CA－MRSA多感染無相關危險因素的健康人群，且發病年齡較輕［1］；其常攜帶多種與致病力相關的外毒素，其中殺白細胞（PVL）毒素被證實能夠引起壞死性筋膜炎、敗血癥、中毒休克綜合征等多種進行性、壞死性疾?。?］，嚴重者甚至死亡。因此，有必要對CA－MRSA進行毒力檢測及同源性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2007年1月至2008年9月門診及住院患者連續分離、不重復非痰標本CAMRSA菌株5例，其中濃汁3份，血液2份。

1.1.2 主要試劑及儀器 細菌基因組提取試劑盒，博日生物技術有限公司；Taq酶及PCR相關試劑，寶泰克大連生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脈沖場凝膠電泳試劑，美國Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脈沖場凝膠電泳儀（美國Bio－Rad），HZQ－F160振蕩培養箱（上海）；超速低溫離心機（貝克曼）；紫外凝膠成像儀（美國Alpha Innotech）。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用細菌基因組提取試劑盒，按照說明提取基因組DNA。

1.2.2 PVL基因檢測 引物設計及參數參照文獻［3］，上 游 引 物：5’－ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA－3’，下 游：5’－GCAT－CAACTGTATTGGATAGCAAAAGC－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因經PCR擴增陽性，片段大小與預計值相符，產物經上海生工有限公司純化、測序，在GenBank比對確證。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳分析 新鮮菌株包埋于1%低熔點瓊脂中，溶葡球菌素及溶菌酶進行破壁（37℃，2h），蛋白激酶 K原位消化（50℃，48h），經限制性內切酶SmaI酶切（25℃、140r／min，4h）；參數：電場強度6V／cm，溫度14℃，角度120°，脈沖時間5－40s，電泳22h，EB染色20min，分析結果。結果判定標準：酶切后圖譜完全一致為A型；圖譜與A比較，3條帶差異以下者為同一型的不同亞型，4－6條者為不同基因型。

2 結果

2.1 脈沖場凝膠電泳結果

3株SCCmec基因型Ⅳ型菌株為同一克隆株A型，2株Ⅴ型菌株分別為A1、A2亞型，電泳結果見圖1。

圖1 脈沖場電泳結果

2.2 PVL基因檢測

結果顯示3株SCCmecⅣ型CA－MRSA分離株PVL基因陽性（其測序結果見圖2）。

圖2 PVL基因測序結果

3 討論

自從1997年在紐約首次發現社區相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染以來，全球范圍內關于CA－MRSA感染的報道接連不斷，其較強的傳播能力和定植能力及其攜帶的毒力基因對于疾病的發生、發展都起到了十分重要的作用，使其易造成感染的暴發和流行，引起發病率和死亡率升高。

PFGE方法是進行染色體DNA分型，將基因組的整體基因片段進行分析，主要應用于近期內引發感染疾病的菌株間同源性分析，其分辨能力強，被譽為基因分型技術的“金標準”。本研究發現，3例CA－MRSA菌株（P14、2997、E14）PFGE圖譜一致，其余2株為該型的不同亞型，具有高度的同源性。

雖然文獻［4］顯示C A－MRSA在基因結構上僅攜帶對β－內酰胺類抗菌藥物耐藥的mecA基因耐藥程度較低，但與HA－MRSA不同攜帶多種毒素，其獨力更強，本研究顯示5株CA－MRSA中有3株攜帶PVL毒素，遠高于 HA－MRSA［5］。應引起臨床廣泛注意。

［1］Jenum PA，Walberg M，R?nning EJ，et al.An outbreak of methicillin－resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward［J］.Tidsskr Nor Laegeforenk，2008，17；128（8）：933.

［2］Delaney JA，Schneider－Lindner V，Brassard P，et al.Mortality after infection with methicillin－resistant Staphylococcus aureus（MRSA）diagnosed in the community［J］.BMC Med，2008，6：2.

［3］Vandenesch F，Naimi T，Enright MC，et al.Community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus carrying Panton Valentine leukocidi genes：world wide emergence［J］.Emerg Infect Dis，2003，9：978.

［4］Gorwitz，RJ，Jernigan，DB，Powers，JH，et al.In the CDC－Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community：summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention［G］.

［5］Gillet Y，Issartel B，Vanhems P.Association between Staphylococcus aureus strains carrying the gene for Panton-Valentine leukocidin and hightly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients［J］.Lancet，2002，359：753.