NGF及其受體TrkA和p75在發(fā)情周期內(nèi)Wistar大鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)

王曉明，白 石，丁 軍

（1.臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院 解剖與組織胚胎學(xué)教研室，浙江 臺(tái)州 318000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射科，吉林 長春 130033）

NGF及其受體TrkA和p75在發(fā)情周期內(nèi)Wistar大鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)

王曉明1，白 石1，丁 軍2＊

（1.臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院 解剖與組織胚胎學(xué)教研室，浙江 臺(tái)州 318000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射科，吉林 長春 130033）

目的 檢測NGF及其受體TrkA和p75在發(fā)情周期內(nèi)Wistar大鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)。方法利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測NGF及其受體TrkA和p75在卵巢內(nèi)的細(xì)胞定位及蛋白表達(dá)情況；利用原位雜交方法檢測在發(fā)情周期內(nèi)大鼠卵巢NGF及其受體TrkA和p75的mRNA表達(dá)情況；利用Western blot技術(shù)檢測發(fā)情周期內(nèi)大鼠卵巢NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示發(fā)情周期內(nèi)大鼠卵巢內(nèi)NGF及其受體的表達(dá)，在各級(jí)卵泡的卵泡細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及黃體內(nèi)均有不同水平的表達(dá)；同時(shí)間點(diǎn)的原位雜交檢測結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相一致；Western blot檢測結(jié)果顯示整個(gè)發(fā)情周期內(nèi)卵巢內(nèi)的NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達(dá)沒有明顯的波動(dòng)。結(jié)論NGF及其受體TrkA和p75可促進(jìn)發(fā)情周期內(nèi)Wistar大鼠卵巢卵泡的卵泡細(xì)胞及卵母細(xì)胞的發(fā)育。

卵巢；NGF；TrkA；p75；卵泡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0040）

神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophin，NTs）家族中的一員，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞存活和分化所必需的靶源性營養(yǎng)因子［1］。NGF常通過激活其特異性受體，酪氨酸激酶受體A（tyrosine kinase A，TrkA）和p75，主要是通過激活TrkA來調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活和分化。NGF與TrkA結(jié)合激活了一系列的胞內(nèi)信號(hào)通路，如ERK和AKT途徑，來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和分化［2］。而p75可與活化的TrkA結(jié)合來強(qiáng)化NGF的作用。在沒有TrkA的情況，活化的p75將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。但NGF及其受體，TrkA和p75并非只在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，亦可表達(dá)在免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)內(nèi)［2－5］。已有報(bào)道在多種雌性哺乳類動(dòng)物的卵巢細(xì)胞內(nèi)均有NGF和（或）TrkA，p75表達(dá)，如在成年女性［6－8］，雌性大鼠［9，10］、金黃地鼠［11］、牛［12，13］、綿羊［14，15］以及芝山羊［16］卵巢內(nèi)均有表達(dá)。NGF及其受體可能是通過自分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)卵巢的諸多功能，如性成熟［17］，卵泡發(fā)育和 排卵［18，19］。但 NGF 及 其受體TrkA和p75在發(fā)情周期內(nèi)雌性Wistar大鼠卵巢細(xì)胞內(nèi)的周期性變化還未見報(bào)道。

1 材料方法

1.1 動(dòng)物

雌性成年 Wistar大鼠，30只，雄性成年 Wistar大鼠5只，購自杭州師范大學(xué)動(dòng)物中心，1月齡，體重90－110g，按性別分開飼養(yǎng)。

1.2 發(fā)情期的判定

大鼠安靜飼養(yǎng)，普通飼料及飲水。通過兩種方法判定發(fā)情期：定期檢測晨起（8點(diǎn)）大鼠陰道涂片，監(jiān)測陰道脫落上皮發(fā)育情況。當(dāng)有較多的有核上皮細(xì)胞出現(xiàn)，死亡角化上皮細(xì)胞較少，且無白細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，提示此期大鼠處于發(fā)情前期［20，21］；通過發(fā)情期行為判定，發(fā)情期大鼠，活躍不安，多動(dòng)；當(dāng)將雄性大鼠放入雌性大鼠籠后，雄性大鼠有追尾、嗅尿，主動(dòng)騎跨現(xiàn)象。兩種方法均陽性時(shí)，判定為大鼠發(fā)情周期的第0天0小時(shí)。

1.3 取材

大鼠的發(fā)情周期一般為4－5天，較規(guī)律。實(shí)驗(yàn)分別于發(fā)情周期的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，即8h（排卵期），24h，32h，70h，80h（或0時(shí)），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材6只。脫頸處死大鼠，取雙側(cè)卵巢備用。一側(cè)卵巢，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，片厚3－5 μm，用于免疫組織化學(xué)染色及原位雜交染色，另一側(cè)卵巢用于Western blot檢測。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

一抗為兔抗大鼠NGF、兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75單克隆抗體，稀釋度為1∶200；SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒，均為北京中杉生物試劑有限公司產(chǎn)品。按試劑盒說明書操作。光學(xué)顯微鏡觀察染色強(qiáng)度，結(jié)果用＋，－號(hào)表示（強(qiáng)陽性：＋＋＋，陽性：＋＋，弱陽＋，陰性：－）。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照，對(duì)照切片操作過程同上，但不加特異性一抗，一抗用PBS代替。

1.5 mRNA原位雜交

NGF、TrkA和p75三種因子的mRNA原位雜交檢測試劑盒（POD），均購自武漢博士德生物試劑有限公司。原位雜交程序均按試劑盒說明操作，以大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)為陽性對(duì)照，以PBS代替雜交液作陰性對(duì)照。

1.6 Western blot

取卵巢放入玻璃勻漿器中勻漿，取勻超聲粉碎組織細(xì)胞，離心12 000rpm 3－5min，吸取上清備用。上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定（購自索萊寶生物科技有限公司，上海）蛋白質(zhì)總量，操作步驟按說明書進(jìn)行。各時(shí)間點(diǎn)均取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色，檢測NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達(dá)水平。抗體為：兔抗大鼠NGF，兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢內(nèi)原始卵泡、初級(jí)卵泡及有卵泡腔的卵泡（次級(jí)和成熟卵泡）的發(fā)育及各因子的表達(dá)情況。各時(shí)間點(diǎn)的卵巢內(nèi)均有上述3種類型的卵泡。原始卵泡體積較小，在白膜的下方；初級(jí)卵泡的體積稍大，無卵泡腔，位置在白膜下較深處，體積大小較均一；有卵泡腔的卵泡，數(shù)量較少，位于白膜下方或近白膜處，體積較大，或可見卵丘。其中有卵泡腔的卵泡（次級(jí)和成熟卵泡）在8h時(shí)，數(shù)量最多；前兩種卵泡的數(shù)量，在各時(shí)間點(diǎn)均未見明顯量的變化。對(duì)黃體數(shù)量的觀察結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均有黃體，黃體體積較大，近白膜。24h及32h時(shí)，黃體數(shù)量最多，黃體內(nèi)細(xì)胞密集，細(xì)胞體積較大；80 h時(shí)雖亦檢測到黃體存在，但黃體內(nèi)結(jié)締組織較多，細(xì)胞體積較小。

2.1.1 NGF及其受體TrkA和p75在原始卵泡內(nèi)的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：在各時(shí)間點(diǎn)的原始卵泡的卵泡壁及卵母細(xì)胞內(nèi)，NGF及其受體TrkA和p75的表達(dá)均呈陰性。見圖1。

2.1.2 NGF及其受體TrkA和p75在初級(jí)卵泡內(nèi)的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：NGF及其受體TrkA和p75在各時(shí)間點(diǎn)的初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞內(nèi)均呈陰性。各時(shí)間點(diǎn)的卵壁內(nèi)NGF及TrkA和p75均呈陽性表達(dá)，其中8h時(shí)，染色強(qiáng)度最強(qiáng)，見表1，圖1。

表1 發(fā)情周期內(nèi)卵巢內(nèi)初級(jí)卵泡內(nèi)NGF及其受體TrkA和p75的表達(dá)

2.1.3 NGF及其受體TrkA和p75在有卵泡腔卵泡內(nèi)的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：NGF及其受體TrkA和p75在各時(shí)間點(diǎn)的有卵泡腔卵泡的卵母細(xì)胞及卵泡壁內(nèi)均呈陽性表達(dá)，其中8h和80 h時(shí)染色強(qiáng)度較度，見表2，圖1。

表2 發(fā)情周期內(nèi)卵巢內(nèi)有卵泡腔卵泡內(nèi)NGF及其受體TrkA和p75的表達(dá)

2.1.4 NGF及其受體TrkA和p75在黃體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)卵巢內(nèi)的黃體細(xì)胞內(nèi)均有NGF及其受體TrkA和p75陽性表達(dá)。其中NGF和TrkA在24h時(shí)表達(dá)較強(qiáng)，而p75則在80h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，見表3。

2.2 mRNA原位雜交結(jié)果

mRNA原位雜交結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，詳見表1、表2和表3，圖2。

表3 發(fā)情周期內(nèi)卵巢內(nèi)有卵泡腔卵泡內(nèi)NGF及其受體TrkA和p75的表達(dá)

2.3 Western blot檢測結(jié)果

于各時(shí)間點(diǎn)，NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達(dá)量相似。圖3。

圖1 8h時(shí)NGF在卵巢內(nèi)的表達(dá)（IHC）。陽性細(xì)胞內(nèi)可見棕黑色顆粒。★為有卵泡腔卵泡，▲為初級(jí)卵泡，↑為原始卵泡。20×

圖2 8h時(shí)TrkA在卵巢內(nèi)的表達(dá)（原位雜交）。陽性細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色顆粒，▲為初級(jí)卵泡，↑為原始卵泡。40×

圖3 發(fā)情周期內(nèi)NGF，TrkA和p75蛋白在Wistar大鼠卵巢內(nèi)的表達(dá)

3 討論

大鼠的性周期一般為4－5天，性周期較規(guī)律，可根據(jù)陰道涂片檢測脫落上皮的發(fā)育情況將發(fā)情周期分為5期［20］，即發(fā)情前期，發(fā)情期，發(fā)情后期I，發(fā)情后期II，及發(fā)情間期。一般發(fā)情前期可持續(xù)9－18小時(shí)，發(fā)情期可持續(xù)6－12小時(shí)，發(fā)情后期I期可持續(xù)18－24小時(shí)，發(fā)情后期II期，可持續(xù)12－24小時(shí)，而發(fā)情間期一般可持續(xù)36－42小時(shí)。與卵巢卵泡的發(fā)育期存在大致的對(duì)應(yīng)關(guān)系為，發(fā)情前期為排卵前期，即成熟卵泡形成期；發(fā)情期為排卵期，此期，即將排卵；其它三期為生長卵泡發(fā)育期。為保證我們選的取材時(shí)間點(diǎn)均在發(fā)情周期的每個(gè)時(shí)段內(nèi)，每一時(shí)間點(diǎn)均選在每一期的中期。

卵巢屬于女性的內(nèi)生殖器官，亦屬于內(nèi)分泌腺，可分泌FSH、LH等多種激素，激素的分泌與顆粒細(xì)胞，即卵泡壁細(xì)胞，以及黃體等結(jié)構(gòu)有關(guān)［22］。黃體在人類可分月經(jīng)黃體和妊娠黃體，月經(jīng)黃體的存在取決于排出的卵是否受精［22］。在大鼠，非靈長類動(dòng)物，每孕多胎，每次排卵多個(gè)，且沒有月經(jīng)的形成，故黃體退化較慢，長時(shí)間內(nèi)黃體一直存在［20］。人類的卵泡出生時(shí)有70－200萬個(gè)，青春期時(shí)，僅剩4萬個(gè)左右；女性一生只排400多個(gè)，其余均于不同階段退化［22］，大鼠卵巢內(nèi)亦有類似的退化現(xiàn)象，退化是一種凋亡過程［22］，我們的結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)原始、初級(jí)及有卵泡腔卵泡的卵泡壁內(nèi)卵母細(xì)胞內(nèi)p75均有表達(dá)，但量有不同，時(shí)多時(shí)少。有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)有活化的TrkA存在時(shí)，p75可與之結(jié)合，可強(qiáng)化NGF的作用；當(dāng)TrkA不存在時(shí)，p75可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示閉鎖卵泡的形成可能與p75表達(dá)有關(guān)。閉鎖卵泡可以發(fā)生在卵泡各個(gè)階段。同時(shí)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道NGF可促進(jìn)性腺的發(fā)育［2］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在不同期的卵泡的卵泡壁及卵母細(xì)胞內(nèi)NGF均有一定的表達(dá)。眾所周知NGF是通過TrkA受體完成調(diào)控作用的［2］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)TrkA的檢測結(jié)果與NGF的檢測結(jié)果一致。但Western blot結(jié)果顯示，NGF及其受體在卵巢內(nèi)表達(dá)的總蛋白水平在整個(gè)周期內(nèi)并沒有明顯的波動(dòng)，這可能與激素的分泌有關(guān)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察到非卵泡細(xì)胞，如卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，NGF及其受體于各時(shí)間亦有表達(dá)，且表達(dá)趨勢呈與NGF等在卵泡上的表達(dá)趨勢相反的現(xiàn)象，數(shù)據(jù)未統(tǒng)計(jì)。

總之，我們觀察了發(fā)情周期內(nèi)Wistar大鼠卵巢內(nèi)NGF及其受體的細(xì)胞定位及表達(dá)水平，結(jié)果顯示NGF及其受體均有不同程度的表達(dá)，提示NGF及其受體可能對(duì)卵泡的發(fā)育有促進(jìn)作用。

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The expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovary during the estrous cycle

WANGXiao-ming，BAIShi，DINGJun.（DepartmentofAnatomyandEmbryologyofTaizhouUniversity，Taizhou318000，China）

ObjectiveTo detect the expression of NGF and its receptors TrkA and p75in Wistar rats ovary during the estrous cycle.MethodsImmunohistochemistry for the localization and protein expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovarian cells；In situ hybridization for the mRNA expression of NGF and its receptors TrkA and p75 in the ovary during the estrous；Western blotting for the protein amount of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary during the estrous.ResultsThe results of immunohisochemistry showed there were different expression levels of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary，included the follicles，oocytes and corpus luteum in the ovary during the estrous；the results of in situ hybridization during the same period showed the same mRNA levels change of them as immunohistochemsitry results showed；but the results of Western blot during the same period showed there were not obviously change of the protein amount change of NGF and its receptor TrkA and p75.ConclusionNGF and its receptors TrkA and p75can promote the development of follicle cells and oocytes in the Wistar rat’s ovary during the estrous cycle.

ovary；NGF；TrkA；p75；follicle

R329.1

A

1007－4287（2012）01－0040－04

＊通訊作者

2010－09－23）