江西省黃鼬和鼬獾狂犬病流行病學監測＊

趙敬慧，張守峰，劉 曄，陳 奇，苗富春，2，王林棟，李易潞，扈榮良

2.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種古老的人獸共患傳染病，死亡率幾乎為100%。狂犬病在我國大部分地區流行，嚴重危害公共衛生安全。在我國，除犬外野生動物可能也是重要的傳播宿主和貯存宿主，野生動物狂犬病尚無系統研究。鼬獾（Melogalemoschata）是一種在我國華東、東南丘陵地區廣泛分布的小型鼬科動物。本研究室對江西、浙江、安徽等地區野生動物鼬獾進行的狂犬病流行病學調查表明，上述地區鼬獾種群內存在狂犬病的獨立傳播，與人狂犬病關系密切［1－2］；并有一株鼬獾狂犬病毒變異株JX09－17（fb）與浙江地區犬源分離株同源性較高，可能與犬狂犬病溢出有關［3］。

該地區另一種數量較大夜行野生動物——黃鼬（Mustelasibirica），俗稱黃鼠狼，廣泛分布于我國各地區，生活習性與鼬獾相似，晝伏夜出，與鼬獾同為夜行動物。黃鼬狂犬病在波多黎各、格林納達、多米尼加、古巴、南非和加勒比海岸地區均有報道，而且黃鼬分離株與犬源分離株核酸同源性較高，不同地區黃鼬分離株彼此差異較大，可能是分別感染了不同的狂犬病病毒株［4－9］。國內并沒有黃鼬狂犬病的報道，為了解我國黃鼬是否攜帶狂犬病病毒，以及黃鼬、鼬獾、犬3種動物之間是否存在交叉感染，針對江西省部分地區野生動物黃鼬及鼬獾進行狂犬病流行病學監測，確定其狂犬病感染狀況，為我國狂犬病的防治策略的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2011年11月到2012年2月，在江西省共收集黃鼬腦組織樣品1 102份，鼬獾腦組織樣品210份，見表1。

表1 黃鼬、鼬獾腦組織樣品來源地區分布Tab.1 Original place distribution of samples

1.2 直接免疫熒光檢測（FAT） 按直接免疫熒光法進行狂犬病病原檢測［11］。取小腦和腦干組織少許，在載玻片上制備組織觸片；腦組織觸片自然風干，置于80%丙酮溶液內固定（4℃，20 min），取出自然風干；以PBS（0.01 mol/L，p H7.4）稀釋FITC標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體 （由本實驗室制備）為工作液；將觸片置于染液內，37℃染色60 min；以洗液（1L PBS中加0.5 m L Tween－20）浸洗染色后觸片，洗滌3次；洗滌后滴加80%甘油1～2滴，加蓋玻片后熒光顯微鏡下觀察。陰性對照為正常鼠腦組織，陽性對照為狂犬病病毒BD06株鼠腦毒。

1.3 狂犬病病毒分離 采用小鼠腦內接種方法［10］，對FAT檢測陽性的樣品進行病毒分離。制成10%懸液，于4℃以2 000 r/min離心20 min，取上清接種。1～3日齡昆明種乳鼠（購自長春生物制品研究所實驗動物中心），約10只/窩，乳鼠和母鼠同籠飼養。乳鼠腦內接種0.03 m L/只，觀察5～21 d。取發病或死亡的小鼠腦組織用于FAT和RTPCR檢測。

1.4 N基因和G基因的擴增與序列測定 狂犬病陽性腦組織，TRIzol法提取總RNA，以特異引物進行反轉錄，用2對引物進行PCR，擴增狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白全基因序列，反應體系為：模板2 μL，10× PCR buffer 5μL，d NTP Master Mix 4 μL，Ex－taq DNA 聚合酶0.5μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水補至總體積50μL。反應條件為：95℃變性3 min后，于95℃30 s，52℃30 s，72℃100 s循環擴增30次，最后72℃延伸10 min。陰性對照為正常鼠腦組織，陽性對照為狂犬病病毒BD06株。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如擴增獲得1.7 kb（N基因）與1.8 kb（G基因）左右條帶，回收PCR產物，送Ta KaRa公司，用擴增引物對PCR產物直接測序。拼接后核蛋白基因ORF（1 353 bp）及糖蛋白基因ORF（1 575 bp），見表2。

表2 N基因和G基因擴增引物Tab.2 Primers for amplification of N and G genes

1.5 DNA序列與分析 文件轉換使用Clustal W軟件包，用MEG4軟件以鄰位相連法構建系統發生樹。本研究中用于比較分析的狂犬病毒N基因和G基因序列來源于GenBank，見圖3，各毒株信息：GenBank登錄號/毒株/宿主/來源地區/分離時間。

2 結 果

2.1 樣品檢測與病毒分離 1 102份黃鼬腦組織樣品FAT檢測結果呈陰性。210份鼬獾腦組織樣品FAT陽性4份，可見明亮的蘋果綠或黃綠色熒光顆粒，呈不同形狀和大小。陽性鼬獾樣品腦內接種3日齡乳鼠，共分離到4株狂犬病毒，分別命名為JX12－64、JX12－67、JX12－102、JX12－234，這4株街毒在乳鼠腦內接種后在7～15 d發病。發病乳鼠腦組織FAT呈陽性，見圖1。

2.2 基因擴增產物鑒定 取5μL PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果4株狂犬病病毒在1.7 kb及1.8 kb處均可見目的條帶，與預期大小相符，見圖2。

2.3 GenBank登錄號 4株新分離鼬獾源狂犬病病毒N基因和G基因序列已錄入GenBank，登錄號（圖3）：JX12－64 N基因JQ950446，G基因JQ950447；JX12－67 N 基因JQ950448，G 基因JQ950449；JX12－102 N基因JQ950450，G基因JQ950451；JX12－234 N基因JQ950452，G基因JQ950453。

2.4 基于N基因和G基因構建系統進化樹分析見圖3，JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234，這4株狂犬病病毒同屬基因1型，病毒之間N基因和G基因的同源性較高，分別為99.6%～100%和99.7%～100%，與浙江鼬獾分離株（ZJ－LA，F02等）和部分江西其他鼬獾分離株（JX08－45，JX08－48，JX08－47）同源性也較高，分別為99.6%～100%和99.7%～100%，進化關系較近，處在同一進化分支，而且與疫苗株（CTN181和CTN7）同源性較高，分別為94.6%～95.1%和92.9%～93.6%，與浙江和福建犬源分離株（ZJ－QZ，D01，FJ008，FJ009等）同源性88.2%～88.8%和87.6%～87.7%。

圖1 FAT檢測黃鼬和鼬獾腦涂片（A）鼬獾陽性腦組織涂片；（B）正常黃鼬腦組織涂片；（C）陰性對照；（D）陽性對照Fig.1 FAT of ferret badger and yellow mongoose brainA：Brain of ferret badger with suspected rabies；B：Yellow mongoose brain；C：Negative control；D：Positive control

圖2 鼬獾狂犬病病毒N基因和G基因RT－PCR結果（A）N 基 因 1～4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234；5：空白對照；6：陰性對照；7：陽性對照；8：DL2000 Marker；（B）G 基 因 1～4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，JX12－234；5：空白對照；6：陰性對照；7：陽性對照；8：250 bp MarkerFig.2 RT－PCR results of N and G genes from ferret badger rabies virus（A）N－gene；Lane 1 to 4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，and JX12－234，respectively；5：PCR－negative control；6： Uninfected brain negative control；7：Positive control；8：DL2000 marker（B）G－gene.Lane 1 to 4：JX12－64，JX12－67，JX12－102，and JX12－234，respectively；5：PCR－negative control；6： Uninfected brain negative control；7：Positive control；8：250 bp marker

3 討 論

黃鼬狂犬病主要報道于加勒比海沿岸地區，最早報道于1950年波多黎各，而后在古巴、格林納達、多米尼加和南非等地也有報道［4－9］。我國并沒有黃鼬狂犬病的相關報道，本研究首次對我國江西省黃鼬和鼬獾進行了狂犬病流行病學監測，不僅對該地區黃鼬和鼬獾感染狂犬病情況有初步了解，同時，為野生動物狂犬病相關研究提供流行病學數據，也為野生動物狂犬病控制提供依據。

圖3 基于我國RV流行毒株N基因（A）和G基因（B）構建系統進化樹（A）N基因；（B）G基因；各毒株信息：GenBank登錄號/毒株/宿主/來源地區/分離時間Fig.3 The neighbor－joining phylogenetic tree of representative Chinese rabies virus isolates，using the N and G gene sequencesA：N gene；B：G gene；Information of RV：Gen－Bank no./isolate/host/origin/isolation date

黃鼬與鼬獾腦組織樣品主要來源于江西省的新建縣、安義縣、永修縣、高安縣、南昌縣、景德鎮等地區，集中在江西省北部環鄱陽湖地區。對鄱陽湖地區野生動物黃鼬和鼬獾進行狂犬病流行病學監測，一方面因為這一地區鼬獾種群內存在狂犬病的流行，黃鼬與鼬獾都是夜行動物，有交叉感染的可能；另一方面鄱陽湖近年來持續干旱，枯水期提前，豐水期推遲，2011年年初到年底，湖區水域面積減少近三分之二，甚至部分地區出現飲水困難的情況，生態環境的變化可能導致野生動物的活動范圍與區域的改變，也可能會增加狂犬病擴散傳播的幾率。本次監測結果顯示，1 102份黃鼬樣品，FAT結果都為陰性，210份鼬獾樣品，FAT陽性4份，經MIT分離獲得4株狂犬病病毒。對這4株病毒N基因和G基因遺傳進化分析，新分離4株鼬獾源狂犬病病毒同屬基因1型，同源性較高，與浙江省鼬獾分離株（ZJLA，F02等）和江西省其它鼬獾分離株（JX08－45，JX08－48，JX08－47）同源性在96%以上，遺傳進化關系也較近，處在同一進化分支，但與浙江和福建犬源分離株（ZJ－QZ，D01，FJ008，FJ009等）同源性88%左右，與疫苗株CTN181和CTN7同源性較高。CTN181是上世紀50年代分離自我國山東淄博的疫苗株，與廣東分離株（GN07）和貴州分離株（Guizhou＿A101和 Guizhou＿A103）同源性較高，遺傳進化關系也較近，而且與本研究分離的鼬獾源狂犬病病毒同處一個進化分支。這一分支的病毒曾經于上世紀60年代左右在我國廣泛流行［11］，為何近年來在鼬獾種群內流行，是由犬傳播給鼬獾，還是由于鼬獾就是作為重要的貯存宿主，將病毒傳播給犬和人，這需要長期的監測分析與研究。此前有研究顯示，鼬獾源狂犬病病毒JX09－17（fb）株與江西、浙江、河北等地犬源分離株同源性較高，而與浙江和江西鼬獾分離株同源性相對較低，可能是由于犬狂犬病的溢出導致鼬獾感染［3］，這仍需進一步研究來確定。

以上結果表明，采樣地區黃鼬樣品中未發現狂犬病病毒感染，而鼬獾感染狂犬病病毒陽性率較高，說明在鼬獾種群內存在狂犬病的流行。從犬與鼬獾狂犬病病毒株同源性較低的情況來看，二者交叉傳播或溢出的可能較低，黃鼬和鼬獾盡管都屬于夜行動物，但二者交互感染的可能性很低。江西省野生動物種類繁多，數量較大，因此應加強該地區野生動物狂犬病的監測。

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