粉塵螨Ⅰ類變應原瞬時表達載體的構建及其在煙草中的表達＊

李朝品，石 連，李秋雨，姜玉新

2.安徽理工大學醫學院病原生物與免疫學教研室，淮南232001

過敏性哮喘為臨床常見病、多發病，而粉塵螨Ⅰ 類變應原（Derf1）是誘發過敏性哮喘最重要的變應原［1］。變應原特異性免疫治療（Allergen－specific immunotherapy，ASIT）是目前治療過敏性哮喘的唯一病因療法［2］，但目前進行ASIT所用的變應原浸液成分復雜、易產生副作用［2－3］，因此變應原的制備必須標準化［1－2］。重組DNA技術可實現變應原的標準化［3］，并提高 ASIT的安全性［4］。本文擬將粉塵螨Ⅰ類變應原基因Derf1構建于瞬時表達載體TRBO（TMV RNA－based overexpression）中，通過PCR、測序、酶切等分子生物學技術鑒定后，侵染煙草葉片，觀察其表達情況，以期獲得表達于煙草的Der f 1蛋白，為后期大規模生產粉塵螨變應原疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 粉塵螨 從蕪湖某面粉廠的地角粉中分離獲得，經形態學鑒定證實為粉塵螨，并進行大規模培養。

1.1.2 本 氏 煙 （Nicotianabenthamiana）：8～12 w，由本實驗室種植。

1.1.3 菌株E.coliDH－5α為本實驗室保存；根癌農桿菌GV1301株由浙江大學生物技術研究所吳建祥教授惠贈。

1.1.4 質粒 p MD18－T載體購自 Ta KaRa公司；TRBO質粒由浙江大學生物技術研究所吳建祥教授惠贈。

1.1.5 引物 根據 GenBank公布的Derf1（EF139429.1）基因序列設計特異引物，上游引物：5′－ATG GAT CCA GCG CTT GCC GTA TCA ATT CGG TTA AC－3′，下 游 引 物：5′－CTC GAG GTT GTT TCC GGC TTG GAA ATA TCC G－3′，并引入PacI和NotI酶切位點，由生工生物工程（上海）有限公司合成。擴增片段長度為627 bp。

1.1.6 工具酶TaqDNA聚合酶及高保真即用PCR擴增試劑盒、限制性內切酶PacI和NotI購自生工生物工程（上海）有限公司；T4DNA連接酶購自TAKARA公司；MMLV first strand cDNA synthesis Kit購自BBI（加拿大）公司。

1.1.7 主要試劑 Trizol?購自Invitrogen公司；硝酸纖維素膜、氨芐青霉素和卡那霉素購自BBI（加拿大）公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、San－Prep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、100 bp DNA ladder、DAB顯色試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 DNA Marker購自 Ta KaRa公司；PacI、NotI、PageRuler?Unstained Protein Ladder（SM0661）購自 Fermentas公司；抗β－actin抗體、HRP標記的羊抗兔二抗購自Sigma公司；兔抗Der f 1抗體為本實驗室保存；其他均為國產分析純。

1.1.8 主要儀器 Beckman高速冷凍離心機，Bio－Rad水平和垂直電泳儀、細菌培養箱、Syngene G：BOX化學發光熒光凝膠成像系統、BTX ECM630電擊轉化儀。

1.2 方法

1.2.1Derf1基因的擴增 根據粉塵螨避光的特性，收集約500只用Trizol?一步法提取總RNA。Derf1基因的反轉錄反應：粉塵螨總RNA 2μL，Oligo（d T）18引物（0.5μg/μL）1μL，dd H2O 9μL，70℃預變性5 min，冰浴30s，加入5×反應緩沖液4 μL，RNase inhibitor（20 U/μL）1μL，d NTP Mixture（10 mmol/L）2μL，充分混勻后，37℃孵育5 min。加入 MMLV reverse transcriptase（20 U/μL）1μL，37℃孵育60 min。70℃滅活逆轉錄酶。PCR體系（20μL）為：cDNA 1μL，10×PCR Buffer 1 μL，d NTP Mixture 1μL，Derf1上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase（5 U/μL）1μL，dd H2O 14 μL。反應條件：94℃4 min，94℃30 s，55℃45 s，72℃1 min，共35個循環，最后72℃延伸10 min。RT－PCR產物行1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/m L的溴化乙錠，下同）電泳，用DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段。

1.2.2Derf1基因克隆載體的連接及測序鑒定

將RT－PCR產物和p MD18－T載體按1∶8的摩爾濃度比用T4DNA連接酶16℃連接12 h，將連接產物電擊轉化入感受態E.coliDH－5α中。電擊條件為電壓2 500 V，電阻100Ω，電容50μF。后涂布含氨芐青霉素（50μg/m L）的LB板，37℃過夜。隨機挑取克隆進行質粒提取、PCR擴增及PacI和NotI雙酶切鑒定，PCR反應體系及反應條件同1.2.1所述；酶切體系（20μL）按說明書進行，操作如下：p MD18－T－Derf1模板5μL，10×酶切緩沖液2 μL，10×BSA（0.1 mg/m L）2μL，PacI（10 U/μL）1 μL，NotI（10 U/μL）1μL，dd H2O 9μL；混勻后37℃反應3 h，酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性克隆進行測序驗證，由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2.3 質粒TRBO的擴增 將含TRBO的E.coliDH－5（接種在含50μg/m L卡那霉素的LB液體培養基中37℃培養過夜。按照說明書進行質粒抽提。

1.2.4 重組質粒TRBO－Derf1的構建及電擊轉化 按常規方法進行目的基因和載體的制備及連接，并根據1.2.2所述的條件電擊轉化根癌農桿菌（A.tumefaciens）GV1301菌株。

1.2.5 重組質粒TRBO－Derf1的PCR及酶切鑒定 以從A.tumefaciens中抽提的重組質粒TRBO－Derf1為模板進行PCR。同時用PacI和NotI對重組質粒進行雙酶切，酶切體系按照說明書進行，同1.2.2所述。

1.2.6 Der f 1在煙草葉片中的表達 挑取含TRBO－Derf1重組質粒的GV1301陽性克隆于含抗生素（Km＋Rif，各50μg/m L）的YEP液體培養基培養至OD600≈0.5，3000×g離心10min收集菌體，無菌水重懸，再次離心收集菌體，用含終濃度為10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES（p H5.6）和200μmol/L乙酰丁香酮（As）的無菌水重懸浮，調整菌液濃度至OD600≈1.0，室溫下放置3 h；用1 m L注射器針頭在煙草葉片背面刺2個小孔，按住葉面小孔處，用無針頭的針管將菌液沿小孔慢慢注入葉片組織空隙。取接種3、4、5、6 d后的煙草葉片（同時設健康植株為對照）；按1∶4（w/v）加入提取緩沖液（50 mmol/L phosphate，p H 8.0；10 mmol/L Tris，p H 8.0；500 mmol/L NaCl；0.1%Tween－20；0.1%NP－40；0.1% β－巰 基 乙 醇；1 mmol/L PMSF），研磨數分鐘；4℃12 000×g離心20 min；取上清，進行SDS－PAGE（12.5%）電泳檢測。

1.2.7 Western blot鑒定 取15μL上述提取的總蛋白，加等體積的2×SDS加樣緩沖液混合，沸水浴10 min，冰浴冷卻進行SDS－PAGE電泳（分離膠濃度為12.5%）。將蛋白轉移至硝酸纖維膜。以5%脫脂牛奶的PBST（含0.01%的 Tween－20的PBS緩沖液）37℃封閉轉移膜1 h，加1∶25 00倍稀釋液的Der f 1抗體為一抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min/次，共5次，用HRP酶標二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min/次，共5次，用DAB底物進行顯色。出現條帶立即中止反應，拍照。設2次獨立的重復試驗以驗證結果的可靠性。

2 結 果

2.1Derf1基因的 RT－PCR 擴增 RT－PCR 擴增產物的電泳結果顯示在500～750 bp之間有一條清晰條帶，其大小與預期的Derf1基因片段大小基本一致，見圖1。

2.2Derf1基因克隆載體的鑒定 將載體p MD18－T和 RT－PCR 產物連接后轉化 DH－5α，挑選單個菌落進行PCR擴增以及PacI和NotI雙酶切鑒定，電泳結果顯示獲得了相應大小的擴增片段（圖2）和酶切片段（圖3），表明重組克隆載體已成功構建。陽性菌落測序，經BLAST序列比對分析確認為Derf1基因，進一步表明已成功克隆Derf1基因。

圖1 Der f 1的RT－PCR產物M：DL2000分子量標準；1：Der f 1基因 RT－PCR產物；2：陰性對照Fig.1 Product of Der f 1 by RT－PCR M：DL2000 DNA marker；1：RT－PCR product of Der f 1；2：Negative control

圖2 重組質粒p MD18－T－Der f 1的PCR鑒定M：DL 2000分子量標準；1、2、4：含重組質粒p MD18－T－Der f 1的陽性菌；3：陰性菌Fig.2 Identification of recombinant plasmid p MD18－TDer f 1 by PCRM：DL 2000 DNA marker；1，2，4：Positive bacterial colonies containing recombinant plasmid p MD18－T－Der f 1；3：Negative bacterial colony

2.3 重組質粒TRBO－Derf1的PCR鑒定 將載體TRBO和基因片段Derf1的酶切產物連接后轉化GV1301菌株，隨機挑取單菌落行PCR反應，可擴增出大小為627bp左右的目的基因片段（圖4）。2.4 重組質粒TRBO－Derf1的雙酶切鑒定 經PacI和NotI雙酶切后，電泳結果顯示質粒TRBO呈現唯一條帶，而重組質粒TRBO－Derf1則分別呈現TRBO載體片段和627bp大小的Derf1基因片段（圖5）。

2.5 重組質粒TRBO－Derf1在煙草葉片中的表達 含重組質粒TRBO－Derf1的GV1301菌株注射本氏煙草葉片3、4、5、6 d后提取煙草總蛋白，進行SDS－PAGE電泳，結果顯示，在注射后的5 d和6 d Der f 1蛋白的表達明顯升高（圖6），且大小與預期大小相一致（約25 k D），表明Der f 1蛋白可成功表達于煙草葉片中。Western blot進一步得到證實（圖7）。

圖3 重組質粒p MD18－T－Der f 1的酶切結果M：DL2，000分子量標準；1：Pac I和Not I雙酶切空質粒p MD18－T；2，3：Pac I和 Not I雙 酶 切 重 組 質 粒p MD18－T－Der f 1Fig.3 Double digestion of p MD18－T－Der f 1 plasmids by Pac I and Not IM：DL2000 DNA marker；1：p MD18－T plasmid double digested by Pac I and Not I；2，3：Recombinant plasmid p MD18－T－Der f 1 double digestion by Pac I and Not I

圖4 重組質粒TRBO－Der f 1的PCR鑒定M：DL 2000分子量標準；1－4：含重組質粒 TRBO－Der f 1的陽性菌Fig.4 Identification of recombinant plasmid TRBO－Der f 1 by PCRM：DL2000 DNA marker；1－4：Positive bacteria colonies containing recombinant plasmid TRBO－Der f 1

圖5 重組質粒TRBO－Der f 1的酶切鑒定結果M：100 bp DNA ladder；1：Der f 1基因 PCR 產物；2：TRBO空載體；3：重組質粒TRBO－Der f 1的Pac I和Not I雙酶切產物Fig.5 Double digestion of p MD18－T－Der f 1 plasmids by Pac I and Not IM：100 bp DNA ladder；1：PCR products of Der f 1 gene；2：TRBO plasmid double digested by Pac I and Not I；3：Recombinant plasmid TRBO－Der f 1 double digested by Pac I and Not I

圖6 接種不同時間煙草總蛋白中Der f 1蛋白的檢測M：蛋白 Marker；1：未處理煙草；2－5：分別為 GV1301侵染3、4、5、6 d的煙草總蛋白Fig.6 Detection of Der f 1 protein from total protein in tobacco leaves harvested at different timeM：Protein marker；1：Untreated tobacco；2－5：Total protein in tobacco leaves harvested at 3，4，5 and 6 day after infiltration

圖7 Western blot驗證接種不同時間煙草總蛋白中Der f 1蛋白M：蛋白 Marker；1：未處理煙草；2－5：分別為 GV1301侵染3、4、5、6 d的煙草總蛋白Fig.7 Detection of Der f 1 protein from total protein in tobacco leaves harvested at different time by Western blotM：Protein marker；1：Untreated tobacco；2－5：Total protein in tobacco leaves harvested at 3，4，5 and 6 day after infiltration

3 討 論

粉塵螨是常見的氣傳變應原，可引起哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎等多種變態反應性疾病，80%左右的哮喘患者對塵螨過敏［5－6］，其中粉塵螨Ⅰ類變應原是最主要的變應原之一。ASIT是唯一可改善變應性疾病自然病程且療效顯著的治療措施。但塵螨變應原粗浸液因成分復雜、易產生嚴重的副作用等原因使其應用受到限制，故應用基因工程技術研制標準化的塵螨變應原疫苗備受關注［7－8］。本文用RT－PCR方法以Derf1基因的特異性引物從粉塵螨總RNA中克隆出Derf1基因，測序并經BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比對分析后，進一步確認為Derf1基因，為標準化的粉塵螨變應原疫苗的制備提供基礎材料。

用分子生物學技術從原材料中大規模分離純化變應原耗時長、成本高、難以解決純度和避免副反應等問題的發生［9－10］，因而難以滿足其實際需要。轉基因植物在藥用蛋白中的應用越來越受重視［10］。植物生物反應器作為一種安全、便捷和經濟轉基因重組蛋白生產系統而被廣泛接受，并成功應用于抗體、疫苗、工業酶、生物多糖等的生產。其中，煙草是重要的植物反應器之一。煙草花葉病毒（TMV）可侵染多種植物并能高水平復制而被廣泛用作載體表達外源基因。TRBO（TMV RNA－based overexpression）載體為改進型的TMV載體，具有轉染效率高、外源蛋白高表達等特點［11－12］，是生產外源重組蛋白的較好選擇。本研究利用分子生物學技術將Derf1基因正向插入到TRBO載體中，通過PCR、雙酶切等生物學方法鑒定后，表明該基因已克隆入TRBO載體，并成功轉化到了農桿菌GV1301菌株中。接種本氏煙草葉片后在第5 d和6 d可見Der f 1蛋白明顯表達，并通過Western blot得到進一步驗證，為在煙草中的大規模表達Der f 1蛋白奠定了基礎。目前正大規模分離純化Der f 1蛋白并進行過敏性哮喘的變應原特異性免疫治療的動物實驗研究，檢測其過敏原性及免疫原性，探討其臨床應用前景。

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