培養結合PCR檢測生物制品支原體污染的研究

張 娜，李書光，陳金龍，胡琳琳，沈志強

2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600

支原體是一類缺乏細胞壁的最小微生物，能在細胞培養中生長繁殖。目前支原體污染組織、細胞、疫苗的現象越來越嚴重，據統計，有36%～87%的細胞株被支原體污染［1－2］，其中豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、發酵支原體、萊氏無膽甾支原體占全部污染的98%［3］，其余的僅占2%。支原體污染嚴重時，宿主細胞特性發生變化，包括生長特性、酶結構、染色體及細胞膜成分并誘導細胞病變，影響細胞的功能和代謝［4］。因此，受支原體污染的細胞、組織等用于疫苗生產將產生不良后果。支原體檢測方法主要有分離培養法、電鏡法、血清學方法以及核酸探針法等，但都存在著種種不足［5］，本實驗應用傳統培養和PCR技術相結合的方法，綜合利用傳統培養方法的精準和PCR檢測方法的快速，大大提高了檢測效率，又不失其精準度。

1 材料與方法

1.1 材料 雞滑液囊支原體和豬鼻支原體購自中國獸醫藥品監察所，Taq DNA 聚合酶、DL2000、p MD－18T均購自大連寶生生物工程有限公司，改良Frey氏液體培養基和固體培養基、支原體液體培養基和固體培養基均參照《中國獸藥典》制備。1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設計與合成 根據GenBank中報道的支原體基因序列及其他細菌基因序列就行同源性比對分析，設計合成4條引物，Z－1，Z－2，Z－J和Z－Z。Z－1和Z－2一對引物參考倪紅霞等［6］，在此基礎上補充2條下游引物Z－J和Z－Z，PCR擴增片段大小為280 bp左右。

1.2.2 檢測樣品總DNA的提取 檢測樣品為本公司所生產的不同批號和來源的各種疫苗半成品、成品，細胞株，血清等。取樣品900μL，加入100μL 10%SDS和10μL protein K，55℃，水浴1 h后，酚氯仿抽提，沉淀用20μL滅菌水溶解，－20℃保存備用。

1.2.3 PCR反應體系 反應體系為25μL。10×PCR Buffer 2.5μL（Mg2＋），2.5 mmol/L d NTPs 2 μL，25μmol/L引物各1μL，模板2μL，Taq酶0.5 μL，補水至總體積為25μL；95℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環，最后延伸10 min。擴增后的PCR產物做1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下分析擴增效果。1.2.4 檢測樣品中陽性產物的克隆和序列分析

使用DNA凝膠回收試劑盒回收280bp的目的片段，將回收的DNA與p MD18－T載體連接，連接產物轉化感受態E.coliDH5α。陽性克隆菌液送上海生工生物有限測序，分析污染支原體的種類。

1.2.5 培養法和PCR相結合檢測支原體污染方法的應用 參照《中國獸藥典》檢驗方案進行培養法檢測支原體污染，同時樣品進行PCR檢測。判定標準如下：若PCR檢測結果為陽性，判定生物制品為支原體感染；若PCR檢測結果為陰性，依培養法的結果為判定依據。

2 結 果

2.1 支原體標準株的PCR鑒定結果 我們用該引物擴增支原體標準株豬鼻支原體和雞滑液囊支原體，結果顯示，2種支原體在280 bp處均有特異性條帶（圖1）。將特異性產物回收、測序，測序結果顯示，與豬鼻支原體和雞滑液囊支原體的核苷酸同源性為100%。

2.2 培養法和PCR相結合檢測支原體污染方法的應用 共檢測生物制品樣品224份，判定為陽性的份數為25份。PCR陽性產物克隆、測序，結果經Blast比對分析，我公司污染生物制品的主要是精氨酸支原體、口腔支原體和豬鼻支原體，為污染生物制品的常見支原體。

圖1 雞滑液囊支原體、豬鼻支原體的PCR擴增結果M：Marker 2000；1：豬鼻支原體；2：雞毒支原體；3：空白對照Fig.1 The PCR results of Mycoplasma synoviae and Mycoplasma hyorhinisM：DL2000 Marker；1：Mycoplasma hyorhinis；2：Mycoplasma gallisepticum；3：Blank control

圖2 部分樣品的PCR檢測結果1：空白對照；2－8：樣品；9：陽性對照Fig.2 PCR results of some samples1：Blank control；2－8：Samples；9：Positive control

3 討 論

Z－1，Z－2上下游引物由倪紅霞等設計合成，特異性、靈敏度均較高，理論上可檢測出近30種支原體，包括最常污染細胞的5種支原體，且對污染細胞的細菌無特異性，在此基礎上補充2條下游引物，使該方法檢測支原體的種類涵蓋常見的生物制品支原體污染種類及生產中的弱毒和強毒。用該方法和傳統培養法同步檢測血清、疫苗、細胞株等樣品224份，PCR檢測出陽性25份，陽性率為11.2%，培養法檢出陽性13份，陽性率為5.8%，這說明PCR方法比傳統培養法靈敏、特異，且檢測時間大大縮短。

目前，支原體檢測方法比較多，最常用的是熒光染色法和培養法，熒光染色法具有檢驗樣品的限制［7］，而且因背景熒光的存在，使實驗結果不準確。培養法作為檢測支原體污染的經典方法，是其他各種檢驗方法的標準，具有不可替代性，但其也有自身的弱點，其檢驗周期較長，操作相對繁瑣。我們進行檢測時將培養法和PCR方法同步進行，為保證生物制品的純粹判定。該方案綜合利用PCR方法快捷和傳統培養法精準的優勢，提高支原體污染陽性樣品的檢出速度，保證支原體陰性樣品檢驗的合格率，為各企事業單位的生物制品和細胞系支原體污染提供一個更為切實可行的方案。

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