雄黃對MRL/lpr狼瘡小鼠抗ds-DNA抗體和T細胞表面分子CD69、CD25表達的影響

徐衛東 范永升 谷煥鵬 溫成平

雄黃為硫化物類礦物雄黃的礦石，又名黃金石。《神農本草經》記載：“黃金石，辛溫，主寒熱，鼠瘺，惡瘡，疽痔，死肌，殺白蟲毒。”《金匱要略》記載含有雄黃的升麻鱉甲湯用于治療陰陽毒，而陰陽毒與系統性紅斑狼瘡（SLE）的癥狀很相似。中醫臨床上主要用于祛風除濕，解毒殺蟲。雄黃既可入丸散作為復方使用，也可單獨應用。近年來，雄黃及其復方應用于白血病治療，取得肯定的臨床療效，其基礎研究也獲得了可喜的成績，展示了廣闊的應用前景，使人們重新認識雄黃。新近的研究表明，雄黃能增強內皮系統的吞噬功能，誘導腫瘤細胞凋亡[1-3]；成靜等[4]報道三氧化二砷對小鼠免疫功能有抑制作用；朱小春等[5-6]報道雄黃的主要成分之一三氧化二砷劑可以減輕MRL/lpr狼瘡小鼠的臨床癥狀，提示雄黃也可能具有治療SLE的作用。然而國內外對雄黃的安全性和免疫調節作用機制研究很少。本實驗初步觀察了雄黃對SLE動物模型抗雙鏈DNA抗體及T細胞表面活化分子CD69、CD25表達及其生存時間的影響，旨在探討中藥雄黃治療狼瘡的價值，并研究其具體的分子作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 天然雄黃納米顆粒，購自上海延真納米材料科技發展有限公司，用雙蒸水配成混懸液，低中高劑量組濃度分別為：0.01 mg/ml，0.02 mg/ml，0.03 mg/ml。ConA，美國Sigma-Aldrich公 司。anti-mouse-CD3、anti-mouse-CD69和anti-mouse-CD25單克隆熒光抗體，美國Santa-cruz公司。RPMI1640完全培養液、胎牛血清等培養品，英國Gibico公司。GC-1200C放射免疫計數器，購自北方生物技術研究所。MRL/lpr狼瘡小鼠，4周齡，雌性，購自上海實驗動物中心。流式細胞儀，美國BeckmanCoulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 選擇實驗模型小鼠100只，隨機將其分為空白對照組，納米雄黃低、中、高劑量組，每組各25只。空白對照用蒸餾水0.2 ml，納米雄黃各組均用0.2 ml混懸液，每天灌胃一次。所有動物均飼養在同一動物房，自由飲食活動。

1.2.2 小鼠生存時間和體重的觀察 兩組分別于實驗開始后第0、15、30、45、60、75、90天取血檢測血清指標，生存時間觀察至第180天。

1.2.3 血清的采集和抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體測定 所有小鼠均于實驗設計點采取尾血標本并稱體重，血清分離后于-70℃保存待測抗ds-DNA抗體。采用GC-1200C放射免疫計數器測定抗dsDNA抗體的效價，嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.2.4 淋巴細胞懸液的制備 實驗結束后，將各組MRL/lpr小鼠斷髓處死，無菌分離小鼠的雙側頜下、腋窩、淺腹股溝及腸系膜淋巴結，200目篩網過濾，收集細胞，用冷PBS洗滌細胞兩次（250×g，5 min）后，細胞重懸于RPMI1640完全培養液中，調整細胞密度為2×109·L-1，0.2%臺盼藍染色判斷活細胞百分率達97%。

1.2.5 淋巴細胞培養 將密度為2×109·L-1淋巴細胞懸液接種在24孔細胞培養板上，每孔1 ml，然后分別加入多克隆刺激劑ConA （終濃度5 μg/ml），在37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h。

1.2.6 T細胞表面活化分子CD69、CD25的檢測 采用直接免疫熒光標記法染色，取出各孔細胞懸液離心濃縮后加入anti-mouse-CD3-PE、anti-mouse-CD69-FITC或anti-mouse-CD25-FITC 1μg/106細胞，混勻后，4 ℃避光作用30 min，PBS洗滌細胞兩次（250×g，5 min），以4%多聚甲醛固定，24 h內進行流式細胞儀檢測。

1.2.7 流式細胞儀檢測及分析 全部數據經Beckman Coulter流式細胞儀和Protocol軟件獲取，每管樣品檢測10 000個細胞，獲得的數據用Protocol軟件分析。

1.3 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，根據資料特征，兩樣本均數的比較采用t檢驗或秩和檢驗，多組間比較采用Oneway-ANOVA，兩組間比較用非配對Students t-test，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雄黃對各組MRL/lpr狼瘡小鼠生存時間的影響見表1。

表1 雄黃對各組MRL/lpr狼瘡小鼠生存時間的影響 只（%）

從表1可以看出，實驗90 d時，雄黃低、中、高劑量組分別存活18、19、20只（72%、76%、80%）和對照組17只（68%），但各實驗組和對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；至180 d時，雄黃低、中、高劑量組分別存活12、14、17只（48%、56%、68%），對照組存活9只（36%），差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組兩兩組間比較，只有高劑量組與低劑量組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 各組實驗前后MRL/lpr小鼠血清抗ds-DNA效價和體重比較見表2。

表2 各組實驗前后血清抗ds-DNA效價和體重比較（±s）

表2 各組實驗前后血清抗ds-DNA效價和體重比較（±s）

*與對照組同期比較，P<0.05；△與低劑量組比較，P<0.05

實驗前組別實驗90 d 實驗180 d ds-DNA（IU/ml） 體重（g） ds-DNA（IU/ml） 體重（g） ds-DNA（IU/ml） 體重（g）對照組（n=25） 32.31±1.32 28.2±1.9 46.45±2.13 28.1±1.9 67.45±2.13 27.9±1.8低劑量組（n=25） 32.41±1.28 27.2±1.6 38.43±1.66* 29.2±2.1 19.18±1.34* 27.2±1.9中劑量組（n=25） 32.56±1.09 26.9±1.3 30.57±1.21* 27.1±1.7 16.16±1.14* 27.1±1.7高劑量組（n=25） 32.74±1.11 25.8±1.2 28.45±1.08* 26.9±1.6 10.19±0.89*△ 26.3±1.9

由表2可見，到第90天，納米雄黃低、中、高劑量各組抗ds-DNA抗體已較對照組低，其中中、高劑量組與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；到第180天，治療各組的抗ds-DNA下降得更多，實驗各組與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；其中高劑量與低劑量比較，差異也有統計學意義（P<0.05）。各組治療前后體重均無明顯變化。

2.3 雄黃對MRL/lpr小鼠T細胞表達CD69和CD25的影響見表3。

表3 雄黃對MRL/lpr小鼠T細胞表達CD69和CD25的影響（±s）

表3 雄黃對MRL/lpr小鼠T細胞表達CD69和CD25的影響（±s）

*與對照組比較，P<0.05

組別 CD3+CD69+ CD3+CD25+對照組（n=25） 98.52±0.39 87.61±0.42低劑量組（n=25） 68.32±0.32* 66.60±0.31*中劑量組（n=25） 57.65±0.76* 49.03±0.46*高劑量組（n=25） 46.27±0.32* 31.76±0.36*

從表3可以明顯看出，經多克隆刺激劑PDB和ConA刺激48 h后，對照組CD69和CD25表達明顯增加。而雄黃高中低各劑量組MRL/lpr小鼠T細胞表面的CD69和CD25表達并沒有明顯增加，實驗各組和對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05），說明雄黃對它們的表達有抑制作用。

3 討論

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的自身免疫性疾病，其臨床特征是產生大量自身抗體和多系統、器官受累。世界范圍內SLE的發病率約為50/10萬，我國約為70/10萬，高于日本等其他東亞國家[7]。該病女性發病率較男性高，比例約為9:1，且多見于育齡期婦女。SLE的病因和發病機制至今尚未完全闡明，一般認為是多因素性的，涉及遺傳因素（如染色體畸變、基因突變、染色體數目異常等）、環境因素（如紫外線，化學因素、飲食因素、感染因素和過敏原等）等。他們錯綜復雜的交互作用可引起機體免疫功能的紊亂，產生多種免疫異常，如自身反應性T、B淋巴細胞的過度激活、細胞因子分泌異常和細胞凋亡紊亂等，導致大量致病性自身抗體和免疫復合物的產生，沉積于組織器官而引發相應的病理損害。

MRL/lpr小鼠是SLE模型之一，由于存在凋亡基因的缺陷導致自身反應性淋巴細胞凋亡異常，產生自身抗體。與人類SLE相似，該小鼠均產生針對包括抗ds-DNA抗體在內的高水平IgG型自身抗體，且可能在SLE活動時通過循環和原位免疫復合物在腎小球沉積而介導腎炎[8]。因此，控制這些抗體的分泌成為治療SLE的重要靶點之一。

目前，抗ds-DNA抗體是SLE活動性的重要指標[9]。本實驗結果顯示，MRL/lpr小鼠經雄黃低中高三個劑量組治療3個月后，血清抗ds-DNA抗體比治療前和對照組明顯下降。通過統計分析其具體數據，筆者發現，雄黃治療90 d時，高、中劑量兩治療組已經低于對照組，但低劑量組差異不顯著，據此可推測，90 d時高、中劑量兩組的雄黃已開始起效。180 d時，高中低劑量治療組的抗ds-DNA抗體水平都進一步下降，且與對照組之間差異均有統計學意義，因此，筆者可以認為，一般劑量的雄黃至少要經過三個月以上的治療，才能抑制MRL/lpr小鼠血清中抗ds-DNA抗體的表達。另外，實驗各組治療前后小鼠體重穩定，可推測雄黃對其食欲、能量代謝并無明顯影響。據此可認為，雄黃能抑制MRL/lpr小鼠自身免疫反應，從而緩解SLE病情和延長其生存時間。

現有的研究已經明確，T細胞針對自身抗原的反應是由于對這些自身抗原結構的免疫耐受的破壞。凋亡細胞的清除障礙、感染微生物的持續存在及某些藥物都可以導致免疫耐受的破壞。致病性自身抗原達到一定濃度，以及調節性和殺傷性T細胞的功能缺陷等遺傳因素和感染、藥物等環境因素的共同作用，可導致機體對自身抗原的耐受喪失，出現自身抗原特異性T細胞，并輔助B細胞產生自身抗體。隨著抗原表位擴展，B細胞產生大量的IgG致病性自身抗體，引起LN的發病和SLE的其他癥狀[10]。CD69是目前已知的T細胞活化后表達最早的一個表面分子，在多克隆刺激劑作用下迅速表達，發生從2%～98%的大幅度變化[11]。而CD25是白細胞介素2受體（IL-2R）α鏈，是T細胞中期活化抗原，靜止T細胞表達很少，活化后則大量誘導表達，與IL-2Rβ、IL-2Rγ鏈共同構成高親和力的IL-2R，以供IL-2結合并選擇性支持經抗原刺激而活化的T細胞進行擴增[12]。筆者用ConA來刺激T淋巴細胞表達CD69、CD25。實驗結果表明，雄黃各濃度組對經ConA刺激48 h后T淋巴細胞CD25、CD69的表達均有明顯抑制作用，其差異有統計學意義 (P<0.05)。

本研究結果還表明，180 d時雄黃治療各組MRL/lpr小鼠生存時間比對照組明顯延長，差異有統計學意義（P<0.05），提示雄黃對MRL/lpr小鼠確實可能有治療作用，但其作用機制是多方面，有待更深入的研究。

總之，根據本實驗的結果可以認為，雄黃能抑制MRL/lpr小鼠T細胞表面的CD69和CD25表達，降低血清抗ds-DNA，緩解自身免疫，延緩疾病進程，延長生存時間。本研究為中藥雄黃治療系統性紅斑狼瘡提供了可靠的實驗依據。下一步還需通過實驗研究雄黃通過干預哪條何種細胞信號轉導通路途徑而抑制CD69和CD25的表達，以便更加全面地了解該藥的具體治療機制。

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