HPLC 法測定復方喜樹堿貼膏中喜樹堿的含量

劉偉林

廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

喜樹堿 (Camptothecine)為具抗腫瘤活性，為植物喜樹的果實中提取的生物堿，其注射液作為抗惡性腫瘤藥已在臨床上應用。復方喜樹堿貼膏為喜樹堿、山蒼子油、冰片等的復方橡膠制劑，為角質促成劑，減少局部皮膚角質增生，主要用于斑塊狀，尋常型銀屑病。其主要有效成分為喜樹堿，具有抗腫瘤活性，故對其進行含量測定是產品質量控制的關鍵。該制劑原含量測定方法為紫外導數光譜法，是測定共軛體系的吸收光譜，而復方喜樹堿貼膏除含喜樹堿外，還共存有10-羥基喜樹堿 (10-hgdroxg Camptothecine)、10-甲氧基喜樹堿 (10-methoxy Camptothecine)等同系物，因此其測定受到干擾。現采用HPLC法，將喜樹堿與其他干擾成分分離，結果滿意。

我們采用高效液相色譜法，對喜樹堿進行含量測定方法研究，經方法學考察，其準確性、精密度、重現性均較好，可用于產品的質量控制。

1 儀器與試藥

儀器 ①Waters高效液相色譜儀 (1、600E泵，2487紫外檢測器，717自動進樣器;2、515泵×2，996二極管陣列檢測器，717自動進樣器)，Millennium32色譜工作站，Inertsil ODS-3 C18色譜柱，4.6×250mm，5μm; ② Sartorius BP211D電子天平。

喜樹堿對照品 (20011025)由廣西東蘭藥廠提供 (高效液相法歸一化純度檢查為98.80%。)

樣品 復方喜樹堿貼膏，批號：20080301，20080302，200820303;陰性樣品 (內含除喜樹堿外的其它成分);均由桂林天和藥業股份有限公司提供。

流動相用的甲醇、四氫呋喃均為色譜純，水為純化水。其余試劑均為化學純。

2 試驗及結果

2.1 溶出及提取條件的選定

本品劑型為橡膠膏劑，方中除所含4種原料相互干擾外，基質 (主要由橡膠、松香、溶媒等組成)對含量測定的影響較大，應盡量予以清除。故采取先以石油醚將膏體從載體中溶解分離，再用75%甲醇提取喜樹堿。

經實驗，用75%甲醇提取5次后，提取液在紫外光燈(254nm)下檢視，已無熒光，說明喜樹堿已被提取完全。為保證提取完全，將提取次數定為6次。

2.2 對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取喜樹堿對照品16.14mg(相當于喜樹堿純品15.95mg)，置200ml量瓶中，加甲醇適量，于60℃水浴中振搖溶解，冷卻后用甲醇稀釋至刻度，搖勻;即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去隔膜，剪成細條，混勻，精密稱取適量W(約相當于1/2片)，置錐形瓶中，用石油醚 (60～90℃)20、15、10、10ml攪拌洗滌4次，洗滌液合并，移入分液漏斗中，再用75%甲醇溶液振搖提取 6次 (20、15、15、15、15、15ml，每次用75%甲醇溶液先洗滌錐形瓶中布條)，分取下層液，濾入100ml量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取不含喜樹堿的陰性樣品10片，按“供試品溶液的制備”項下的方法操作，即得。

2.3 色譜條件與系統適用性試驗

2.3.1 色譜條件 柱溫30℃，檢測波長：254nm，流動相：甲醇—10%四氫呋喃 (48：52)，流速：1.0ml/min，進樣量為 20μl。

2.3.2 檢測波長的確定

采用上述的液相色譜條件，取喜樹堿對照品溶液注入液相色譜儀中，進行二極管陣列檢測器光譜掃描，其在253.6nm、358.2nm 和 366.5nm 處都有吸收峰，以 253.6nm吸收最高，故選取254nm作為測定波長。

在上述色譜條件下，分別吸取對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液各20μ1，注入液相色譜儀，色譜圖見圖1、2、3。供試品在與喜樹堿對照品相同的保留時間里有一對應的色譜峰，陰性對照溶液 (缺喜樹堿)無干擾;以喜樹堿計，理論板數為3000，分離度大于1.5，故此色譜條件可滿足測定的要求。

2.4 線性關系考察

精密吸取喜樹堿對照品溶液 5.0、10.0、20.0、30.0、40.0ml，分置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別取上述對照品溶液20μl注入液相色譜儀，測定。以進樣量X(μg)對峰面積Y(A)進行線性回歸分析得回歸方程：y=2584829.1x-6368.3，r=1.0000。

結果表明，喜樹堿進樣量在0.039875～0.319μg范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

吸取供試品溶液 (批號20080301)各20μl，分別連續注入液相色譜儀6次，測定峰面積，RSD為0.25%(n=6)，結果表明精密度良好。

2.6 重復性試驗

取樣品 (批號20080301)，依法操作，平行操作6份，吸取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，計算含量，含量分別為 83.60%、83.94%、84.04%、83.25%、83.77%、83.45%，RSD為0.36%，結果表明重復性較好。

2.7 穩定性試驗

取對照品溶液，按照擬定的含量測定方法測定，放置1、2、4、6、12小時后，再次測定，RSD為0.68%，結果表明溶液穩定性良好。

2.8 回收率試驗

采用模擬回收試驗方法。取陰性樣品 (缺喜樹堿)1/2片，除去隔膜，剪成細條，置錐形瓶中，共9份，分別精密加入喜樹堿對照液 ［精密稱取喜樹堿對照品①66.98mg(相當于 66.18mg)，②82.96mg(相當于 81.96mg)，③99.04mg(相當于97.85mg)，分置 100ml量瓶中，加甲醇適量，于60℃水浴中振搖溶解，冷卻后用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。］1ml，每個濃度加3份，用石油醚(60～90℃)20、15、10、10ml攪拌洗滌四次，洗滌液移入分液漏斗中，按“2.2.2供試品溶液的制備方法”制備供試品溶液，依法測定，計算回收率。結果三種濃度共9份的平均回收率為97.8%(RSD為0.62%，n=9)。

2.9 含量測定及限度

取本品3批，按擬定的含量測定方法測定，結果分別為 83.64%(RSD 為 0.55%，n=2)、90.30%(RSD 為0.15%，n=2)、84.24%(RSD 為 0.60%，n=2)。由結果知，含量均在標示量的83.0% ～91.0%以內，考慮到本品為外用橡皮膏劑，生產工藝煩瑣，樣品含量差異較大，故擬定含量限度為80.0% ～120.0%。

3 討論

本文建立了反相高效液相色譜法測定復方喜樹堿貼膏中喜樹堿含量得方法，為進一步完善復方喜樹堿貼膏的質量標準提供了準確、簡單、可行的測定方法。

我們比較了甲醇-水、乙腈-水及乙腈-10%四氫呋喃等流動相系統，結果發現后者具有最佳分離效果。

在實驗中我們發現，當提取溫度較高時，容易將喜樹堿提取完全。當溫度高于30℃時，提取次數僅為3～4次即可將喜樹堿提取完全，因此為了將喜樹堿提取完全，應控制提取溫度在一個較高的范圍。