超濾質譜法篩選與人血清白蛋白作用的大豆異黃酮粉中異黃酮成分

楊 睿，喻 花，王 獻

(中南民族大學化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074)

1 引言

蛋白質通常是藥物在體內發揮藥理作用的主要靶點，在藥物作用機理的過程中，大多數藥物都是通過與生物大分子靶點相互作用來發揮藥效的。因此，深入研究蛋白質與藥物小分子之間的相互作用的過程和機理，不僅有助于從分子水平上理解藥物的作用機制，也可為篩選以特定蛋白為靶點的藥物先導體以及新藥的開發與設計開辟新的途徑。

目前對藥物分子與生物靶分子的作用的研究主要有以下方法:紫外－可見分光光度法、熒光光譜法、圓二色譜法、色譜質譜聯用法、核磁共振法、電化學方法等［1～5］。近年來，超濾質譜技術的發展為研究藥物分子與生物靶分子的作用提供了新的方法。超濾質譜技術是一種將超濾技術與質譜分析方法聯合使用所形成的一種新的研究手段，主要是利用親和原理，將生物靶分子與潛在藥物分子混合得到受體－配體復合物和未結合的藥物分子，通過超濾來將未結合的藥物分子去除，然后用有機溶劑或者改變溶液pH值將復合物中的藥物分子釋放出來，用LC－MS檢測釋放出來的活性藥物分子進行分析鑒定。該方法將超濾技術的分離特性與質譜技術的高速，高靈敏性，高準確度等特點結合起來，可以很方便的識別與生物靶分子相結合的藥物配體，從而實現先導化合物的快速篩選［6，7］。

大豆異黃酮的基本骨架為3－苯基苯并二氫呋喃，主要有黃豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆苷［8］。天然存在的大豆異黃酮較多，共有12種，它們大多以β葡萄糖苷形式存在，其中起生理藥理作用的主要是染料木素和大豆黃素。大豆異黃酮因具有明顯的生物學活性，如抗腫瘤作用、對血管的防護作用、抗氧化活性、抗炎、改善骨質疏松、類似女性雌激素作用以及抗激素作用等［9］，有關大豆異黃酮類藥物和保健品的開發和應用已經被廣泛關注。

本工作采用超濾質譜的方法，對人血清白蛋白與4種主要的大豆異黃酮及大豆異黃酮粉樣品的結合做了研究，證明了大豆異黃酮粉中的主要成分為大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素，并且以此為模型確立了一套用超濾質譜法篩選快速篩選蛋白質配體的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀(美國 Agilent公司);Agilent 6520 Q－TOF四級桿飛行時間質譜儀(美國Agilent公司);GL－20M高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);YM－10超濾膜購自Millipore公司;大豆異黃酮片購自吉林修正藥業保健品有限公司;人血清白蛋白HSA購于Sigma公司;大豆苷、大豆苷原、染料木素、染料木苷標準品純度均≥95%，購自Sigma公司;甲醇、乙腈均為色譜純(德國MERCK公司);水為超純水(Molelement 1815a摩爾元素型超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司);其他試劑均為優級純。

2.2 樣品制備

樣品制備方法參考已知文獻［13，14］，大豆異黃酮片粉碎60℃真空干燥至恒重，過100目篩板，密封備用。準確稱取5.0 g大豆異黃酮片粉末，按照料液比1∶5加入70%甲醇，浸泡120 min后超聲提取60min，提取液4000 r/min離心15min后取上清備用。大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素標準品用甲醇配成4 mol·L－1的儲備液。人血清白蛋白用10 mM的CH3COONH4溶液(pH 值=6.86)配成40μM備用。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱為 C18分析柱(150 mm×4.6 mm×5μm)，柱溫 25 ℃，流速 0.4 mL·min－1。液相條件:流動相A為純水，B為乙腈，梯度洗脫。t=0 min，80%A(20%B);t=0 ～5 min，70%A(30%B);t=5～15 min，40%A(60%B);t=15 ～20 min，5%A(95%B)。進樣體積為5μL。

2.3.2 質譜條件

電噴霧電離離子源(ESI);負離子模式檢測;掃描范圍m/z 100～1000;毛細管溫度350℃;噴霧電壓4.0 kV;干燥氣流速 10 L·min－1;碎裂電壓 175V。

2.4 超濾實驗

參照文獻方法［10～12］，吸取 10μL 大豆異黃酮粉提取物溶液和人血清白蛋白溶液10μL加至10 mM的醋酸銨緩沖溶液中，室溫反應30 min，置于YM－10型超濾管中于離心力10000r/min下超速離心15 min，濾膜加10 mM醋酸銨緩沖液離心清洗3次，將未結合配體分子洗去。再向濾膜中加入甲醇/水(50∶50;V/V)，靜置30 min后于10000 r/min下離心15 min，重復3次，收集洗脫液用于LC－MS分析。為排除超濾膜自身對于小分子的吸附作用引起的實驗誤差，在每次實驗同時加入一組不加蛋白質的空白實驗作為對照。

3 結果與討論

3.1 標準品混合溶液的液質聯用(LC－MS)分析

將大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4種物質的標準品配置成總濃度為40 μM的混合溶液，其中各組分的最終濃度均為10 μM。優化LC分離條件和ESI－MS的儀器條件對標準品混合溶液進行分離和ESIMS檢測，結果見圖1。

圖1 4種大豆異黃酮標準物質混樣超濾質譜提取離子流圖(EIC)

由圖1可以看到混合溶液在C－18柱中分離出了4個色譜峰，4個組達到了基線分離并且峰型比較對稱無明顯拖尾現象。用Q－TOF質譜數據分析軟件將4種大豆異黃酮物質在負離子模式下可能形成的離子進行分析計算，見表1。

表1 4種大豆異黃酮物質在負離子模式下可能出現的帶電離子類型及精確分子量

圖2中，(a)(b)(c)(d)分別為保留時間1.713min、3.805min、6.848min 和 9.953min 的質譜圖。對比表1可知，圖2(a)中保留時間為1.713min的物質是大豆苷，質譜圖中的主要離子為 m/z 253.05023、415.10324、451.08016、461.10906 和 475.12502，分別為大豆苷元的(M－H)－，(大豆苷具有一定的不穩定性，在本實驗條件下有可能在離子源中或質譜中分解為大豆苷元)，大豆苷的(M－H)－，大豆苷的(M+Cl)－，大豆苷的(M+HCOO)－及大豆苷的(M+CH3COO)－峰。(b)中保留時間為3.805 min的物質是染料木苷，質譜圖中m/z 431.09998的離子為染料木苷的(MH)－峰。(c)中保留時間為6.848min的物質是大豆苷元，m/z 253.05174離子為大豆苷元的(M －H)－峰。(d)中m/z為269.04654為染料木苷的(M －H)－峰，確定9.953min的物質為染料木素。

圖2 4種大豆異黃酮標準物混合溶液中各組分的質譜圖

圖3 pH值6.86時大豆異黃酮粉樣品與HSA的超濾質譜EIC圖

3.2 超濾質譜法篩選大豆異黃酮粉中與人血清白蛋白結合的黃酮類成分

大豆異黃酮粉實際樣品與HSA孵育后，進行超濾實驗，所得溶液進行LC－MS分析，HPLC分離條件和質譜條件與上述標準品一致。對所得到的總離子流圖提取4種大豆異黃酮所可能的電荷分子做EIC提取離子流圖，結果如圖3所示。與空白對照組(即未加蛋白質組)相比，加入HSA蛋白質的樣品組中4組EIC峰都存在不同程度的增加。因為在相同實驗條件下，色譜峰的積分面積與溶液中物質的濃度成正比，通過對比兩組不同實驗色譜峰的積分面積可以知道4種大豆異黃酮與HSA都有著不同程度的結合。圖4中(a)(b)(c)(d)分別為4組峰的MS譜圖。與4種大豆異黃酮標準物的EIC和MS進行比較，通過4組峰的保留時間和每組峰質譜的特征離子，可以確認4個峰所代表的物質按照保留時間先后順序分別為大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素。

圖4 大豆異黃酮粉樣品中四種物質的ESI－MS譜圖

4 結語

本實驗采用超濾質譜法研究大豆異黃酮粉及人血清白蛋白，通過對照標準品的質譜圖以及提取離子流圖確定復雜樣品中與蛋白質靶點結合的有效物質，建立起了一套行之有效的快速篩選天然產物中有效成分的方法。此方法也可以擴展應用于其他天然藥物提取物中活性成分的快速確認和鑒定。

在實驗過程中，應該注意以下幾個關鍵問題:超濾膜的選擇，目前市面上可供選擇的超濾膜有很多種，需要根據對象蛋白質的分子量來選取合適型號的超濾膜，同時還要考慮超濾膜的死體積大小;孵育過程中需要控制蛋白質與配體的相對摩爾比，以達到較好的吸附效果;超濾試驗中解離液的選擇，常用的解離液包括有機溶劑解離液和酸性或者堿性解離液。在本實驗中，由于黃酮苷樣品在酸性條件下會發生水解反應，所以選用的有機溶劑作為解離液。

［1］Caitriona B S，Jaydan A S，Joy L M，et al.DNA affinity binding studiesusing a fluorescentdye displacementtechnique:the dichotomy of the bingding site［J］.Journal of Biological Inorganic Chemistry ，2007(12):819 ～824.

［2］A.Ahmed O，R.Marty，H.A.Tajmir－ Tiahi，et al.Human serum albumin complexeswith chlorophylland chlorophyllin［J］.Biopolymers，2005(77):129 ～136.

［3］C D Kanakis，P A Tarantills，H A Tajmir － Riahi，et al.DNA interaction with naturally occurring antioxidant flavonoids quercetin kaempferol and delphindin［J］.Journal Of Biomolecular Structure And Dynamics，2005(22):719 ～724.

［4］紀竹生，劉買利，胡繼明，等.藥物配體與生物大分子受體相互作用核磁共振的研究進展［J］.分析化學，2004，32(11):1532～1537.

［5］Wang S F，Peng T Z，Yang C F，et al. Electrochemical determination of interaction parameters for DNA and mitoxantrone in an irreversible redox process［J］.Biophysical Chemistry，2003(104):239～248.

［6］Pan Y J，Zhang H，Chen Y Z，et al.New approach for screening anti－ tumor compounds［J］.Chinese Science Bulletin，2003，48(7):630～633.

［7］Zhang H，Gu Q，Pan Y J，et al.Screening for topoisomerase I binding compounds by high－performance liquid chromatography–mass spectrometry［J］.Analyticl Biochemistry.2004(329):173 ～179.

［8］毛峻琴，宓鶴鳴.大豆異黃酮的研究進展［J］，中草藥，2000(31):61～64.

［9］劉志勝，李里特，辰巳英三.大豆異黃酮及其生理功能研究進展［J］，食品工業科技，2000(21):78～80.

［10］Sun Y K，Gu C G，Van Breemen R B，et al.Ultrafiltration tandem mass spectrometry of estrogens for characterization of structure and affinity for human estrogen receptors［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2005(16):271 ～279.

［11］Liu D T，Guo J，Van Breemen R B，et al.Screening for Ligands of Human Retinoid X Receptor－α Using Ultrafiltration Mass Spectrometry［J］.Analytical Chemistry，2007(79):9398 ～9402.

［12］劉 舒，劉志強，劉淑瑩，等.中藥黃芩中神經氨酸酶抑制劑的超濾質譜篩選研究［J］.化學學報，2011(69):1570～1574.

［13］董懷海，谷文英，高效液相色譜－質譜法在大豆異黃酮測定中的應用［J］.糧食與飼料工業，2002(5):48～50.

［14］董淮海，陶冠軍，王林祥，等.高效液相色譜－電噴霧質譜聯用法檢測大豆異黃酮和皂苷［J］.無錫輕工大學學報，2002(21):415～419.