茜草雙酯對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用研究

黃橋華 劉心強 邱倩

缺血-再灌注損傷已經成為威脅人類生命的一個病理生理改變而越來越受到研究者的關注。心肌細胞凋亡是缺血-再灌注損傷的重要表現形式，尤其在缺血-再灌注早期，心肌細胞凋亡作用更為明顯。多年來，研究各種藥物對缺血-再灌注損傷及心肌細胞凋亡的影響一直是科研熱點，也是此領域急需解決的課題之一。因此尋找有效的藥物來抑制細胞凋亡對防治心肌缺血-再灌注損傷具有重要意義。本研究通過建立乳鼠心肌細胞缺氧/復氧模型，使用茜草雙酯的干預，探討茜草雙酯對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物為清潔級出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠，雌雄不限，由贛南醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2 茜草雙酯購自上海第二制藥廠，DMEM培養基、胰蛋白酶、5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)購自Sigma公司，胎牛血清(南美產)購自Hyclone公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、丙二醇(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，細胞凋亡和壞死檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞培養 出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，消毒后取心臟，剪碎后用0.08%的胰蛋白酶消化液消化，用含15%胎牛血清的高糖DMEM終止消化，離心后重懸細胞，吹打均勻后經200目細胞篩濾去細胞團和未消化的組織塊，細胞計數后調整細胞濃度約5×105個/ml，接種至培養瓶中，差速貼壁法分離心肌細胞，加入0.1 mmol/L的BrdU純化心肌細胞，放入37℃CO2培養箱中培養24 h更換培養基，之后根據細胞生長情況1～2 d更換培養基。

1.2.2 心肌細胞缺氧/復氧模型建立 參照文獻［1］方法，根據實驗室裝置建立缺氧復氧模型:在原代心肌細胞中換入無血清高糖DMEM培養基孵育12 h。快速換入經95%N2～5%CO2混合氣平衡的低糖無血清DMEM培養基，并迅速移入該種混合氣充分平衡的單向氣流缺氧裝置中，持續通入95%N2～5%CO2混合氣。細胞缺氧4 h后迅速換入無血清高糖DMEM培養基，并放入95%O2～5%CO2培養箱中孵育。使心肌細胞遭受缺氧/復氧損傷。

1.2.3 實驗分組 原代心肌細胞培養3～4 d后，細胞生長融合且同步搏動良好時分為:①正常對照組;②缺氧/復氧模型預先加茜草組;③缺氧/復氧模型組。

1.2.4 細胞上清LDH、MDA測定 收集各組細胞上清，用LDH、MDA試劑盒檢測上清的上述反應細胞損傷程度的指標。

1.2.5 細胞凋亡與壞死檢測 使用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染的方法檢測，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法 使用SPSS 14.0 for Windows軟件進行統計分析，定量資料以均數±標準差(±s)表示，選擇重復測量的方差分析過程，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞上清LDH、MDA測定結果比較 三組比較發現，正常對照組LDH活性和MDA含量最低，缺氧/復氧模型預先加茜草組和缺氧/復氧模型組LDH活性和MDA含量明顯升高(P＜0.01);缺氧/復氧模型預先加茜草組和缺氧/復氧模型組比較發現，缺氧/復氧模型預先加茜草組較缺氧/復氧模型組LDH活性和MDA含量降低有統計學意義(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組細胞上清LDH活性和MDA含量比較(±s)

表1 各組細胞上清LDH活性和MDA含量比較(±s)

注:與正常對照組比較，(1)P＜0.01;與缺氧/復氧模型組比較，(2)P＜0.05

LDH活性(U/L) MDA含量(nmol/L)17.96±2.01 1.07±0.29缺氧/復氧模型預先加茜草組 62.59±6.09(1)(2) 1.77±0.34(1)(2)缺氧/復氧模型組 116.15±5.77(1) 2.29±0.27(1)正常對照組

2.2 細胞凋亡與壞死檢測結果 在熒光顯微鏡下觀察發現，正常對照組中細胞凋亡和壞死不明顯，而缺氧/復氧模型預先加茜草組和缺氧/復氧模型組有不同程度的細胞凋亡和壞死。與缺氧/復氧模型組比較，缺氧/復氧模型預先加茜草組細胞凋亡和壞死有所減少(見圖1～3)。

圖2 缺氧/復氧模型預先加茜草雙酯組

圖1 正常對照組

圖3 缺氧/復氧模型組

3 討論

缺血-再灌注損傷是心肌組織壞死的常見原因，而細胞凋亡是其發病機制中的重要環節之一［1］。缺血-再灌注損傷的機制尚未完全闡明，目前認為I/R損傷的基礎是細胞能量代謝障礙。心臟是一個高耗能的器官，維持其正常的生理功能需要大量的能量供應，而心肌能量代謝障礙是缺血-再灌注損傷的始動環節［2］。并認為其可能與缺氧/復氧后自由基釋放增加、鈣離子超載及線粒體損傷等變化有密切關系［3-6］。茜草雙酯是人工合成的萘酚化合物［6］，茜草雙酯在臨床上常用于升高白細胞作用［7，8］。目前有研究表明，茜草雙酯對缺血心肌有抗氧化作用［9］。本實驗通過建立缺氧復氧心肌細胞模型，給予茜草雙酯預處理，分別測各組細胞乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量及細胞的凋亡與壞死，發現茜草雙酯對體外培養的缺氧/復氧心肌細胞具有保護和抗凋亡作用。

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