HPLC法同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量

袁春玲，王佩琪，郭偉英（遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

婦可靖膠囊由北敗醬、赤芍等中藥組成，具有清熱利濕、化瘀散結(jié)、行氣止痛的功效，用于治療慢性盆腔炎，證見帶下量多、小腹墜痛、腰骶酸痛等。據(jù)文獻(xiàn)報道，北敗醬中主要含有木犀草素[1]，該成分有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等活性[2]；赤芍清熱涼血、散瘀止痛，其主要有效成分為赤芍總苷，其中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷含量較高[3]。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證其療效，本試驗首次采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量。

1 儀器與試藥

FL2000型HPLC儀，含F(xiàn)L2000紫外檢測器、FL9500S色譜工作站（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）；KQ-100A型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD型電子天平（德國賽多利斯公司）。

木犀草素、芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111520-200809、110736-200805）；婦可靖膠囊（甘肅醫(yī)藥集團西峰制藥廠，批號：080936、081104、090223）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、磷酸為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Chromatrex C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（35∶65）；檢測波長：230 nm（檢測芍藥苷）、350 nm（檢測木犀草素）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20.0 μL。理論板數(shù)按木犀草素峰計算應(yīng)不低于4 000；分離度均＞1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥8 h的木犀草素、芍藥苷對照品適量，置同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成濃度分別為65、50 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品研細(xì)，精密稱取0.5 g，加甲醇50 mL，超聲提取（功率：100 W，頻率：40 kHz）20 min，濾過，殘渣用15 mL甲醇分3次洗滌，洗液合并濾液至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按婦可靖膠囊的組成處方及生產(chǎn)工藝分別制成不含北敗醬和不含赤芍的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法分別制得缺北敗醬和缺赤芍的陰性對照溶液。

2.3 干擾試驗

照上述色譜條件，分別取混合對照品溶液、供試品溶液、2種陰性對照溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，可得供試品中其他成分對木犀草素、芍藥苷的測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺北敗醬的陰性對照；D.缺赤芍的陰性對照；1.木犀草素；2.芍藥苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control without Herba Patrinia；D.negative control without Radix Paeoniae Rubra；1.luteolin；2.paeoniflorin

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得木犀草素的回歸方程為Y＝52 979X－1 883（r＝0.999 9，n＝5），進(jìn)樣量線性范圍為0.065～0.325 μg；芍藥苷的回歸方程為Y＝48 638X－79.69（r＝0.999 8，n＝5），進(jìn)樣量線性范圍為0.05～0.25 μg。

2.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液20.0 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果，木犀草素、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.81%、0.29%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下測定。結(jié)果，木犀草素、芍藥苷的平均含量分別為6.36、1.76 μg·g-1，RSD分別為0.37%、1.16%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品溶液適量，按上述色譜條件每隔1 h進(jìn)樣1次，連續(xù)測定6次。結(jié)果，木犀草素、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.17%、0.68%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：090223）9份，每份約5.0 g，分別按相當(dāng)于樣品中木犀草素、芍藥苷含量的80%、100%、120%的量加入各對照品（不同加入量各3份），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 木犀草素和芍藥苷的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test of luteolin and paeoniflorin（n＝9）

2.9 樣品含量測定

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

本試驗采用超聲技術(shù)提取木犀草素和芍藥苷，筆者分別對提取溶劑（100%甲醇、95%乙醇、水）、提取時間（10、20、30 min）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以100%甲醇為溶劑的提取效率明顯高于其他溶劑，超聲20 min即可將測定成分提取完全，故本試驗中供試品溶液的制備均用甲醇超聲提取20 min。

為同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]并經(jīng)多次試驗，最終擬定以甲醇-0.4%磷酸（35∶65）為流動相。由于木犀草素和芍藥苷的最大吸收波長相差較大，為保證兩者含量測定的靈敏度，故對先流出色譜柱的木犀草素采用350 nm檢測波長，15 min始檢測波長置230 nm檢測芍藥苷。

綜上，本方法簡便、準(zhǔn)確，可用于婦可靖膠囊的質(zhì)量控制。

[1]楊 亮，張亞鋒，王新立，等.HPLC法測定北敗醬中木犀草素的含量[J].陜西中醫(yī)，2008，29（3）：354.

[2]楊 穎，宋曙輝，徐桂花.黃酮類化合物木犀草素研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2009，9：45.

[3]姜曉燕，羅 琳，竇志華，等.HPLC法測定赤芍飲片中芍藥內(nèi)酯苷及芍藥苷的含量[J].齊魯藥事，2008，27（3）：147.

[4]陳華國，靳鳳云，趙 超，等.HPLC法測定對坐葉中木犀草素的含量[J].中國藥房，2009，20（36）：2 838.