仿生化提取人參皂苷類成分的初步研究Δ

陳新，胡朝奇，張洪長，孫艷（.長春中醫藥大學藥學院，長春07；.長春中醫藥大學研發中心，長春 07；.通化萬通藥業股份有限公司，吉林通化 4000）

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Meyer.的干燥根與根莖，人參皂苷為其主要成分之一。傳統溶劑提取法以水、乙醇作為溶劑，采用煎煮法、滲漉法、回流提取等方法進行提取，近年來許多新的提取技術用于人參皂苷，如超聲提取法、微波提取法、超臨界二氧化碳提取法與超高壓提取法等[1，2]。上述提取方法的原理主要基于化學浸提的“相似者相溶”原則。提取溶劑、條件與人體消化系統的生理條件有很大差別，因此得到的有效成分或部位存在體外有效，但進入體內卻無效的現象，而有些在體外無效的成分卻被作為雜質棄去或根本沒有從中藥中提取出來，但這些成分可能在體內胃腸液作用下發生轉化或代謝，而其轉化的成分或代謝產物則具有良好活性，且易于被吸收入血發揮作用，因此傳統方法篩選有效成分的效率較低，且浪費巨大。基于口服藥物的體內運轉過程，筆者提出仿生化提取構想，即建立一種與人體胃腸生理學環境相接近的胃腸道模擬法，提取條件較化學浸提法更接近人體真實的胃腸生理條件，提取溶劑依據胃液和腸液的組成，人工制備成系列提取溶媒，提取溫度在37℃，攪拌動態提取。在國外，胃腸系統的體外模擬試驗已成為一種非常有效的評估污染物方法，目前國際上已有十余種胃腸模擬方法[3]。本研究以人參超微粉為原料，分別以仿生溶媒和水為提取溶劑，以人參總皂苷、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量之和為考察指標，比較2種提取法的提取率，為仿生化提取中藥化學成分可行性提供科學依據。

1 儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜（HPLC）儀，包括SPD-10Av檢測器（日本島津公司）；Spectrumlab752S紫外-可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；ZF-6三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；BMF-6超微粉碎機（濟南倍力粉工程有限公司）；飛鴿LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；KQ-250B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250W，頻率：40kHz）；7321電動攪拌機調速器（上海標本模型廠）。

人參采于吉林省撫松市，經長春中醫藥大學中藥鑒定室鑒定為真品。人參皂苷Re（批號：110754-200822）、人參皂苷Rg1（批號：110703-200221）對照品購于中國食品藥品檢定研究院；胃蛋白酶（1∶3000，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 提取方法

2.1.1 仿生化提取方法 取人參超微粉（藥材60℃真空干燥，超微粉碎，過300目篩）適量，精密稱定，加入仿生溶媒（0.2%氯化鈉、0.32%胃蛋白酶、0.7%鹽酸加水配制成100mL溶液）25倍，置37℃水浴中，攪拌，提取1h，離心，上清液用水飽和正丁醇振搖提取3次，合并正丁醇液，減壓回收，低溫真空干燥，得人參仿生化提取物。

2.1.2 水提取方法 取人參超微粉適量，精密稱定，加入水25倍，置37℃水浴中，攪拌，提取1h，離心，上清液用水飽和正丁醇振搖提取3次，合并正丁醇液，減壓回收，低溫真空干燥，得人參水提取物。

2.2 人參總皂苷含量測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，用甲醇定容于100mL容量瓶中，制成濃度為0.2mg·mL－1的人參皂苷Re對照品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液1.0mL，置具塞試管中，將試管置于冰水浴中，再加入0.5mL 8%香草醛乙醇溶液和77%硫酸5mL，搖勻，混合物置60℃恒溫水浴中加熱10min后，立即在冰水浴中冷卻15min；并在另一試管中加甲醇1.0mL，加隨行試劑，作空白對照，在400～760nm波長范圍內測定人參皂苷Re的吸光度。結果，人參皂苷Re在544nm波長處有最大吸收，故選擇544nm為檢測波長。

2.2.3 線性關系的考察[4]精密吸取人參皂苷Re對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于具塞試管中，將試管置于冰水浴中，分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0mL甲醇后，再加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，搖勻，混合物置60℃恒溫水浴中加熱10min后，立即在冰水浴中冷卻15min，每個樣品做3個平行樣，并在另一試管中加甲醇1.0mL，加隨行試劑，作空白對照，在544nm波長處測吸光度。以人參皂苷Re進樣量（X，mg·mL－1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝3.3318X+0.0284（r＝0.9996）。結果表明，人參皂苷Re進樣量在0.044～0.220mg范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.3 人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量測定方法[5]

2.3.1 色譜條件色譜柱：Zorbax XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（20∶80）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：203nm；柱溫：室溫；進樣量：10μL。理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000。

2.3.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品適量，加甲醇制成每1mL分別含人參皂苷Rg10.24mg、人參皂苷Re0.36mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.3.3 線性關系考察 分別精密吸取2、5、10、15、20μL混合對照品溶液，注入液相色譜儀，記錄峰面積積分值。分別以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的回歸方程分別為Y＝1323.7X－15395（r＝0.9998）、Y＝1659.4X+5200.8（r＝0.9999）。結果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進樣量分別在0.48～4.80、0.72～7.20μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

3 結果

3.1 不同提取方法下人參總皂苷提取率的比較

分別取人參仿生化提取物與水提取物適量，精密稱定，加甲醇制備成0.5mg·mL－1的供試品溶液。按“2.2”項下方法測定，并根據回歸方程計算總皂苷含量，照下式計算總皂苷提取率：提取率＝提取物中總皂苷含量/藥材中總皂苷含量×100%。結果，人參超微粉經仿生化提取后，總皂苷提取率較水提取法高出13%，詳見表1。

表1 不同提取方法下人參總皂苷提取率的比較（n＝3）Tab 1 Comparison of extraction rate of TSPG bydifferent extraction methods（n＝3）

3.2 不同提取方法下人參皂苷Rg1和人參皂苷Re總提取率的比較

分別取人參皂苷仿生化提取物和水提取物適量，精密稱定，加甲醇制備成每1mg·mL－1的溶液，搖勻，經微孔濾膜（0.45μm）濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取2種供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按“2.3”項下方法測定，外標一點法計算含量，并按下式計算提取率：提取率＝提取物中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和/藥材中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和×100%。結果，人參超微粉經仿生化提取后，人參皂苷Rg1，與人參皂苷Re提取率較水提取法高出45%。色譜見圖1；提取率測定結果見表2。

圖1 高效液相色譜圖A.人參皂苷Re和人參皂苷Rg1混合對照品；B.仿生提取物；C.水提取物Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control of ginsenoside Rg1and Re；B.biomimetic extract；C.water extract

表2 不同提取方法下人參皂苷Rg1與人參皂苷Re含量之和及其提取率測定結果（n＝3）Tab 1 Results of the content and extraction rate of the sum of ginsenoside Re and Rg1by different extraction methods（n＝3）

4 討論

決定中藥中的一個、一種或一組化學物質是否為有效化學成分、有效效應物質，由它或它們在體內的行為來確定，其在胃腸內和肝內的行為尤為重要，這已成為中藥實驗醫學中的關鍵性基礎科學問題[6]。Odani T等[7]發現，人參皂苷Rg1的口服生物利用度僅為1.9%～20%。但人參皂苷Rg1可在胃液作用下水解掉一分子葡萄糖生成代謝產物人參皂苷Rh1和人參皂苷F1，而且其代謝產物在血液中濃度較高，這可能是人參皂苷Rg1發揮益智和抗衰老作用的主要活性成分[8]。仿生化提取法得到的提取物HPLC圖顯示，在人參皂苷Rg1和人參皂苷Re色譜峰前后分別出現新的色譜峰，提示在該提取條件下可能有成分轉化或有未被水提取出來的成分，對該成分的確定有待進一步研究。

基于動態模擬人體生理機能的仿生化提取法，本研究主要進行體外模擬胃生理環境條件下對人參皂苷類成分進行提取，仿生化提取結果取決于以下幾個因素：（1）提取溶媒，它是該方法的核心。不同于傳統的提取溶劑，仿生提取溶媒由酶、酸、堿和無機鹽等組成，可按照不同組成和比例配制成系列仿生提取溶媒。胃在不同狀態下pH值不同，如在空腹狀態下pH值一般為1.5左右，飽腹狀態下為4.0左右。而pH值對成分的溶解析出影響很大，仿生提取溶媒可調成不同pH值進行提取。（2）溫度。雖然增加溫度能使擴散系數加大，擴散速度增加，但人體溫度為37℃，故本研究在該溫度下進行提取。國外的十幾種體外胃腸模擬試驗溫度均確定在37℃[5]。（3）提取方式。依據人體消化過程，一方面人體胃是不斷蠕動消化的，在消化和吸收過程中是動態過程；另一方面，根據提取擴散公式[9]G＝D×F（c1－c2）t/δ，濃度差（c1－c2）對提取率有明顯影響，因此選擇攪拌提取。

基于人參皂苷Re在人參藥材中含量較高，文獻報道[10]對人參藥材中總皂苷含量測定亦是選擇該成分作為對照，以此標示人參藥材中總皂苷含量。故筆者以人參皂苷Re作為人參總皂苷含量測定的標示物。

綜上所述，筆者選擇模擬胃生理條件提取人參總皂苷，經仿生化提取的人參皂苷類成分應更易于被人體吸收，從而具有良好的生物利用度。后期研究一方面要進一步考察如壓力或無氧條件對化學成分提取的影響；另一方面將通過動物實驗，證明仿生化提取物的安全性和有效性。

[1] 張 晶，陳全成，弓曉杰，等.不同提取方法對人參皂苷提取率的影響[J].吉林農業大學學報，2003，25（1）：71.

[2] 陳瑞戰，張守琴，王長征.常溫超高壓提取人參總皂苷[J].化工學報，2005，56（5）：911.

[3] 張東平，余應新，張 帆，等.環境污染物對人體生物有效性測定的胃腸模擬研究現狀[J].科學通報，2008，53（21）：2537.

[4] 王利勝，袁愛賢，韓 堅，等.HPLC法測定川芎嗪在小鼠血漿、腦、肝中的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：654.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：8.

[6] 楊秀偉.中藥實驗醫學中的關鍵基礎科學問題[J].中西醫結合學報，2005，3（2）：154.

[7] Odani T，Tanizawa H，Takino Y.Studies on the absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponinsⅡ.The absorption，distribution and excretion of ginsenoside rglin the rat.[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），1983，31（1）：292.

[8] 馮 亮，胡昌江，余凌英.人參皂苷Rg1及其代謝產物的藥代動力學研究[J].藥學學報，2010，45（5）：636.

[9] 屠錫德，張鈞壽，朱家璧.藥劑學[M].北京：人民衛生出版社，1985：634.

[10] 陳發奎.常用中草藥含量測定[M].北京：人民衛生出版社，1997：11-13.