大豆苷元固體自乳化制劑的處方優化和制備

廖九中，張建，崔升淼#（1.深圳市龍崗區橫崗人民醫院，廣東深圳518115；.廣東藥學院中藥學院，廣州510006）

大豆苷元（Daidzein）主要存在于豆科植物大豆和葛根中，是一種天然的植物雌激素。研究表明，大豆苷元具有抗骨質疏松、抗腫瘤、抗氧化、保護心腦血管、提高機體免疫力等多種藥理作用[1～3]。但大豆苷元的水溶性差[4]，導致其普通制劑溶出速度慢、生物利用度低。因此，筆者以固體自乳化釋藥系統[5]（Soild self-emulsifying drug delivery，S-SEDDS）為載體，在偽三元相圖基礎上，用星點設計-效應面法優選自乳化處方，并用固體載體吸附制備大豆苷元固體自乳化制劑，以提高其溶出度。

1 儀器與試藥

AY120電子分析天平（日本Shimadzu公司）；JRCZ-1A溶出試驗儀（上海黃海藥檢儀器廠）；粒徑分析儀（美國Brookhaven公司）；D/MAX-IIIA X-射線衍射儀（日本Rigaku公司）；Pyris1差示掃描量熱（DSC）儀（美國Perkin Elmer公司）；KQ-600KDE高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500W，頻率：40kHz）。

大豆苷元原料藥（成都普瑞法科技開發有限公司，含量＞98%）；二乙二醇單乙基醚（Transcutol P，法國Gattefosse公司）；吐溫80（廣州化學試劑廠）；油酸乙酯（上海飛祥化工廠）；聚乙二醇（PEG）400（廣東汕頭市西隴化工廠）；其余試劑均為藥用輔料。

2 方法與結果

2.1 處方配伍篩選

以乳化劑和油相對大豆苷元的溶解性能為指標，兼顧考慮其乳化能力，對輔料進行篩選。選擇油酸乙酯、魚肝油、油酸、麻油和大豆油為油相，吐溫80為乳化劑，進行配伍篩選，結果見表1。稱取不同比例的處方后，渦旋混合均勻，超聲30min。取0.4g混合物加入到80mL 37℃的蒸餾水中，用磁力攪拌器溫和攪拌，目測自乳化效果。將自乳化效果分為5個級別[6，7]：A級（乳化時間＜1min，溶液澄清，透明或微泛藍光）；B級（乳化時間＜1min，溶液呈半透明，呈藍白色）；C級（乳化時間＜2min，呈亮白色不透明液體）；D級（乳化時間＞2min，色澤暗，呈灰色，略帶油狀）；E級（難乳化，一直有油滴存在）。

表1 不同油相和乳化劑的配伍試驗結果Tab 1 Compatibility test of different oil phases and emulsifiers

由表1可知，油酸乙酯和油酸分別與吐溫80的配伍相容性較好，而以魚肝油、麻油、大豆油為油相時，會出現分層。

2.2 偽三元相圖的繪制

根據油相和乳化劑配伍結果，以乳化性能好的油酸、油酸乙酯為油相，吐溫80為乳化劑；以PEG 400、Transcutol P為助乳化劑，繪制偽三元相圖。結果，以吐溫80-Transutol P-油酸乙酯所形成的自乳化區域最大，且以油酸乙酯為油相的乳化能力優于以油酸為油相的乳化能力。故選擇以吐溫80-Transutol P-油酸乙酯為自乳化處方組成。偽三元相圖見圖1。

圖1 偽三元相圖A.吐溫 80-PEG400-油酸；B.吐溫 80-PEG400-油酸乙酯；C.吐溫80-Transcutol P-油酸；D.吐溫80-Transcutol P-油酸乙酯Fig 1 Pseudo-ternary phase diagramA.Tween 80-PEG400-oleic acid；B.Tween 80-PEG400-ethyl oleate；C.Tween 80-Transcutol P-oleic acid；D.Tween 80-Transcutol P-ethyl oleate

2.3 星點設計-效應面法優化處方

根據偽三元相圖篩選結果，采用星點設計-效應面法[8]優化處方。選擇對微乳形成有顯著性影響的2個因素作為考察對象，即油相質量分數（X1）、乳化劑吐溫80和助乳化劑Transcutol P質量比（Km，X2）。選擇平均粒徑、Zeta電位作為處方評價的因變量。因素水平見表2；試驗設計與結果見表3。

表2 因素水平Tab 2Factors and levels

表3 試驗設計與結果Tab 3 Results of experiment design

采用Statistic 6.0統計軟件，將各效應對2個因素各水平進行二項式擬合，方程如下：Y1＝3.8535+1.73525X1－8.52064X2－2.80574X1X2+0.24279X12+8.11574X22（r＝0.9743）；Y2＝－10.29194－0.50842X1－1.34587X2－0.13056X1X2+0.01443X12+0.52294X22（r＝0.9139）。式中，Y1、Y2代表自微乳粒徑、電位。采用Oringin 7.5統計軟件繪制以上擬合方程的三維效應面，詳見圖2。

圖2 三維效應面A.粒徑、油相質量分數和Km；B.Zeta電位、油相質量分數和KmFig 2Three-dimensional response surfaceA.particle size，oil phase and Km；B.zeta potential，oil phase and Km

從圖2可知，當Km≤2.0時，平均粒徑隨著油相比例的增加而增大，2.0＜Km≤4.0時，平均粒徑隨著油相比例的增加呈先減小后增大的趨勢；當Km≤1.1時，Zeta電位值隨油相比例增加先減小后增大；當1.1＜Km≤4.0時，Zeta電位隨著油相比例的增加而減小，這說明各效應與2因素各水平的非線性擬合較大。本研究以油相量最大，且滿足平均粒徑≤50nm以及Zeta電位≥－20mV為優化指標，最終選擇的優化處方為X1＝25.7%，X2＝2.7。

2.4 大豆苷元固體自乳化制劑的制備

按處方精密稱取吐溫 80（54.2mg）、Transcutol P（20.1mg）、油酸乙酯（25.7mg），渦旋混合均勻，加入9.4mg大豆苷元原料藥，攪拌混合，超聲30min，于37℃水浴中平衡4h，按照自乳化液與β-環糊精1∶4處方比例逐漸加入固體輔料，邊加邊攪拌均勻，加適量95%乙醇制軟材，過40目篩制備顆粒，50℃干燥4h，即得大豆苷元固體自乳化制劑。

2.5 DSC分析法

分別取大豆苷元原料藥、β-環糊精、大豆苷元固體自乳化制劑以及藥物和β-環糊精組成的物理混合物適量，進行DSC分析。檢測條件：升溫溫度為10℃·min－1，掃描溫度范圍為20～400℃，干燥氣體為N2，氣流流速為40mL·min－1。結果，大豆苷元原料藥在338.7℃有一個尖銳的吸熱峰，此為藥物的熔點峰，而在物理混合物和大豆苷元固體自乳化制劑的圖譜中大豆苷元的吸熱峰消失，說明自乳化液和固體載體可以抑制藥物的結晶，證明了大豆苷元以無定形或者分子狀態存在大豆苷元固體自乳化制劑中。DSC圖譜見圖3。

圖3 DSC圖譜Fig 3 DSC spectrum

2.6 X-射線粉末衍射分析

分別取大豆苷元原料藥、β-環糊精、大豆苷元固體自乳化制劑以及藥物和β-環糊精組成的物理混合物適量，置于坩堝中，進行粉末X-射線衍射分析。分析條件：發射器為銅/石墨靶單色器，管流40mA，高壓強度為40kV，掃描角度5°～40°，干燥氣流為N2，掃描速率為2°（2θ）/min。結果，大豆苷元原料藥相應特征峰位置（2θ）：10.25°、15.78°、16.89°、24.49°呈現許多尖銳的晶體特征衍射峰，而β-環糊精在12.39°、18.73°、19.54°、20.65°、22.72°有其特征晶體衍射峰。物理混合物呈現固體載體輔料衍射峰，并且峰強度降低，藥物特征峰基本消失，而在大豆苷元固體自乳化制劑的衍射圖譜中，衍射峰比較平穩，并沒有出現藥物晶體的衍射峰，表明形成了一種新的物相，這進一步證實了大豆苷元以無定形或以分子狀態存在大豆苷元固體自乳化制劑中。X-射線粉末衍射見圖4。

圖4 X-射線粉末衍射圖Fig 4 Powder X-ray diffraction pattern

2.7 溶出度考察

參照《中國藥典》方法[9]，分別稱取適量的大豆苷元原料藥、大豆苷元自乳化制劑和大豆苷元固體自乳化制劑灌裝于硬膠囊中，以900mL蒸餾水為溶出介質，溫度為（37±0.5）℃，轉速為100r·min－1，并分別于 5、10、20、30、45、60min取樣，于249nm波長處測定吸光度，通過回歸方程計算累積溶出百分率（吸光度對大豆苷元檢測濃度的回歸方程為Y＝0.0993X+0.0051（r＝0.9999），大豆苷元檢測濃度線性范圍為1.0～9.0mg·L－1），并繪制溶出曲線，詳見圖5。

由圖5可知，大豆苷元自乳化制劑與大豆苷元固體自乳化制劑在45min的溶出度均可達85%以上，而原料藥60min溶出度不足10%，說明固體自乳化制劑可提高水難溶性藥物大豆苷元的體外溶出度。

圖5 溶出曲線Fig 5 Dissolution curves

3 討論

乳滴的粒徑影響藥物的體內、外釋放速率和體內生物利用度，是一個重要的評價指標。本研究中發現，將大豆苷元制成固體自乳化制劑后與液體自乳化相比，粒徑有所增大，可能是由于固體載體影響的緣故。

優化的大豆苷元固體自乳化制劑溶出度與大豆苷元原料藥相比，有顯著提高，原因可能是微乳傳遞系統增加了大豆苷元的溶解度，使溶出度得到改善。而由DSC和X-射線粉末衍射分析可知，藥物以分子形式存在于制劑中，因而增加了其物理狀態的穩定性。本研究可為進一步開發大豆苷元新劑型提供試驗基礎。在今后的研究中，將進一步研究其體內吸收和生物利用度。

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